贞丰野生茶树叶表特征及解剖结构分析
《南方农业学报》 2022年6期
作者：李美凤，彭 叶，温贝贝，刘 元，刘建军*
（1贵州大学茶学院，贵州贵阳 550025；2坡柳村晟兴种养殖专业合作社，贵州贞丰 562205）
0 引言
【研究意义】茶（）是我国重要的经济作物，在脱贫攻坚和乡村振兴中发挥了重要作用。种质资源是茶树品种创新的物质基础，高抗、高品质、生长发育优良的茶树品种是茶产业高质量发展的基本保障（王新超等，2021），也是茶科技原始创新和新产品开发的战略性资源（金基强等，2021）。贵州是茶树起源地之一，境内野生茶树和群体种资源丰富（安红卫等，2021）。贞丰野生茶树所制茶香气馥郁、滋味浓醇，风味独特，挖掘贞丰野生茶树优良遗传性状，不仅为保护和利用贵州省野生茶树资源提供数据支撑，也有助于筛选适宜贵州本地环境、高抗、品质优良的茶树新品种。【前人研究进展】贞丰野生茶树主要分布于贵州省贞丰县，属于阿萨姆种（var.）（刘声传等，2013），所制茶名为娘娘茶，又名坡柳茶，滋味醇厚，芳香馥郁，在明末清初为皇室贡茶（刘晓霞等，2004）。贞丰野生茶树遗传性状混杂，叶面积大，芽叶外表呈现出紫色、绿色和绿带紫色，芽头肥壮、茸毛密布，叶肉饱满，新梢持嫩性强。研究表明，茶树叶片结构和芽叶的生理性状能反映其抗性与内含物质情况（农玉琴等，2020）。植物的光合作用、呼吸作用和蒸腾作用与叶片气孔密切相关（陈龙干，2020）。芽叶茸毛富含丰富的氨基酸和咖啡碱等，其基部的腺细胞分泌芳香物质，浓密的茸毛还能干扰昆虫产卵及其对芽叶的附着与取食（尹鹏等，2016），表明芽叶茸毛与品质成分和抗性相关。芳樟醇是茶叶重要的香气物质，其含量与叶面积呈正相关（Zeng et al.，2021），花青素和儿茶素是茶叶重要的功能成分（de Moura et al.2022），花青素含量和单体儿茶素/聚合儿茶素比值与茶树芽叶颜色紧密相关（Zhu et al.，2021），表明茶树芽叶颜色和叶片面积能够反映茶叶的品质。茶树叶片的解剖结构分析表明，栅栏组织厚度与叶绿素、类胡萝卜素含量呈正相关，海绵组织厚度与适制性相关（覃秀菊等，2009；傅秀敏等，2021）。叶面茸毛密度、叶表皮细胞厚度、角质层厚度、栅海比、叶片组织结构紧密度和叶片厚度等指标与抗寒、抗旱、抗病虫害和持水能力呈正相关（李鸿雁等，2020；郭艳红等，2021；谭殷殷等，2021；张东等，2021）。以上研究表明，通过分析茶树芽叶形态及解剖结构可推测茶树抗性、茶叶品质和适制性。【本研究切入点】茶树嫩梢形态学和叶片解剖学特征被广泛用于评价茶树的抗逆性、品质性状和适制性（朱燕和黄亚辉，2015），而该技术用于野生茶树种质资源筛选却鲜有报道。【拟解决的关键问题】以福鼎大白茶和龙井43号为对照，对贞丰野生茶树紫芽和绿芽株系的22项形态学特征和叶片解剖结构指标进行数据统计和多元分析，评价野生茶树的综合抗性、内含物质和适制性，为筛选品质优良的贵州本地茶树品种提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以福鼎大白茶和龙井43号为对照，取贞丰野生茶树代表性紫芽株系和绿芽株系的完整枝条，用于比较和分析野生茶树的成熟叶片、芽头和节间距等形态学指标。取相应种质的一芽一叶嫩梢用于解剖学观测。贞丰野生茶树采于贵州省贞丰县龙场镇坡柳村5个不同野生茶树群落，每个地点取3份。样品的地理位置为北纬25°24′36″、东经105°32′24″，海拔1029.44～1111.38 m。福鼎大白和龙井43号采自坡柳村茶园。所有材料的采样时间为2021年9月16日。
1.2 试验设计
1.2.1 叶表特征观察 取每个种质健康枝条完整的新梢和成熟叶片，利用软尺测定芽长（cm）、芽宽（cm）、叶长（cm）、叶宽（cm）和节间长（cm）。利用超景深显微镜（Keyence VHX-5000，基恩士有限公司）观察芽叶表型。用手术刀分别取成熟叶不同区域5 mm×5 mm方形小块，用镊子将下表皮薄膜撕下，置于载玻片上，滴一滴蒸馏水，盖上盖玻片，用显微镜摄像系统Olympus BX53和CellSens Entry观察叶片不同区域的下表皮气孔，计数、拍照。
1.2.2 叶片解剖结构观测 石蜡切片参考陈雪等（2019）方法，主要步骤如下所示：（1）取材：取标准一芽一叶的第一叶，洗净、用滤纸吸干水分，用FAA固定液固定24 h，然后用手术刀将叶片修平整放于脱水盒；（2）脱水：按照75%酒精4 h、85%酒精2 h、90%酒精2 h、95%酒精1 h、无水乙醇I 30 min、无水乙醇II 30 min的顺序，依次进行脱水；（3）透明：醇苯5～10 min、二甲苯I 5～10 min、二甲苯II 5～10 min，至叶片透明；（4）浸蜡：65 ℃融化石蜡I 1 h，65 ℃融化石蜡II 1 h，65 ℃融化石蜡III 1 h；（5）包埋：在包埋框放入融化的蜡，再放入已脱水的叶片，置于-20 ℃冻台冷却至蜡凝固，将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块；（6）切片、拍照：将修整好的蜡块放入-20 ℃冷冻台冷却，再置于石蜡切片机切4 μm厚片；用载玻片将已展平且漂浮于摊片机40 ℃温水上的切片捞起，放入60 ℃烘箱内将水烤干蜡烤化，在显微镜下观测拍照。
1.3 形态学和解剖学指标的数据处理
叶面积计算公式：叶面积=叶长×叶宽×0.75（Yin et al.，2016）。气孔数为下表皮25 mm（5 mm×5 mm）单位面积的气孔数量；隶属函数值（）=（-）/（-），式中为指标测定值，和分别为参试茶树某一指标的最大值和最小值（谢季坚和刘承平，2013）。相关指数=Σ/（-1）（马婷等，2016），式中，为某指标与聚类分析同一分类中其他指标的相关系数，为每个分类中指标个数（韩刚等，2006）。
1.4 统计分析
利用联川生物云平台（https：//www.omicstudio.cn/index）对茶树的叶面形态和解剖结构指标进行主成分分析，利用SPSS 26进行显著性分析和层次聚类分析。
2 结果与分析
2.1 芽的形态特征观测结果
单芽是名优茶加工的重要原料，其芽头粗细与百芽重、内含物质相关。对福鼎大白茶、龙井43号、绿芽株系和紫芽株系的芽头进行测量，结果（表1）表明，芽长排序依次为紫芽株系（2.58 cm）＞绿芽株系（2.28 cm）＞福鼎大白茶（2.21 cm）＞龙井43号（1.49 cm），芽宽排序依次为绿芽株系（0.36 cm）＞紫芽株系（0.30 cm）＞福鼎大白茶（0.22 cm）＞龙井43号（0.16 cm）；绿芽株系的芽宽/芽长比值（0.16）显著高于紫芽株系（0.12）、福鼎大白茶（0.10）和龙井43号（0.11）（＜0.05，下同），说明野生茶树的芽头更粗壮，且绿芽株系的芽头壮于紫芽株系。显微镜观察结果（图1）显示，绿芽株系茸毛极细密，其次为紫芽株系，福鼎大白茶最稀疏。
2.2 新梢节间特征测量结果
节间长是植物遗传多样性的指标之一。从表1可知，4个种质的新梢不同叶位节间长排序均为绿芽株系＞紫芽株系＞福鼎大白茶＞龙井43号。贞丰野生茶树的节间长显著长于栽培品种，绿芽株系在第二三叶、三四叶和四五叶的节间长显著长于紫芽株系。节间长分析结果表明，野生茶树与栽培品种具有显著遗传差异性，野生茶树群落内也存在显著的遗传变异。
2.3 叶片形态特征观测结果
叶面积是植物光合作用能力的重要参数。从表2可知，4个种质成熟叶片的叶形、叶尖、叶缘和叶脉形态相近，但叶色和叶片质地不同，表明其遗传特征具有差异性。由表1可知，叶面积最大的是绿芽株系（52.87 cm），其次为紫芽株系（40.27 cm），龙井43号最小（10.69 cm）。贞丰野生茶树的叶面积显著大于福鼎大白茶和龙井43号，表明贞丰野生茶树光合效率更高，代谢产物更丰富。
叶面观察发现，贞丰野生茶树叶面柔软、光泽性强，隆起程度大，说明其叶肉生长旺盛，叶肉组织发达。紫芽株系的叶脉对数平均为10.40对，绿芽株系平均为11.67对，显著多于福鼎大白茶（7.01对）和龙井43号（6.33对）的叶脉对数（表1），表明与福鼎大白茶和龙井43号相比，贞丰野生茶树的遗传变异性大。紫芽株系为紫芽紫叶紫茎，表明花青素含量高；绿芽株系为绿芽绿叶绿茎，颜色比福鼎大白茶和龙井43号深，表明叶绿素含量更高。通过显微观察发现，绿芽株系叶表茸毛长且极密，完全覆盖叶肉；紫芽株系叶表茸毛长，较密；福鼎大白茶和龙井43号叶表茸毛稀疏（图1），表明贞丰野生茶树芽叶抗病虫害能力较强。4个种质叶表气孔数差异不显著，相同视野内紫芽株系叶片气孔数为76.53，绿芽株系为74.27，显著高于福鼎大白茶（67.67）和龙井43号（49.27）（表1），表明贞丰野生茶树光合作用、呼吸作用和蒸腾效率强于福鼎大白茶和龙井43号。
2.4 叶片解剖特征观测结果
叶片的解剖结构能直观反映植物的生长状态、抗性和干物质含量。由成熟叶片的组织切片（图2、表3）可看出，绿芽株系和紫芽株系的角质层和叶片厚度均显著厚于福鼎大白茶和龙井43号；绿芽株系和紫芽株系的上表皮细胞呈矩形，整齐紧密地排列，福鼎大白茶和龙井43号的上表皮细胞则形状不一，排列不整齐。4个种质的栅栏组织均由2～3层柱形细胞紧密排列而成。
由表3可知，绿芽株系和紫芽株系的上表皮厚度（20.33～21.72 μm）和下表皮厚度（12.83～16.59 μm）均显著厚于福鼎大白茶和龙井43号。绿芽株系的栅栏组织最厚（82.09 μm），福鼎大白茶（76.49 μm）和紫芽株系（70.39 μm）次之，龙井43号（48.41 μm）最薄。与福鼎大白茶和龙井43号相比，绿芽株系和紫芽株系的海绵组织明显更厚，栅海比略低于龙井43号（1.07）和福鼎大白茶（1.01）。福鼎大白茶的叶片组织结构紧密度最高（0.35），其次为绿芽株系（0.34），紫芽株系（0.30）最低。紫芽株系的主脉厚度为740.02 μm，显著厚于其他3个种质。与福鼎大白茶和龙井43号相比，绿芽株系和紫芽株系的主脉木韧比更高。
2.5 贞丰野生茶树与福鼎大白茶和龙井43号各项指标的主成分分析
如图3所示，主成分分析结果表明，第一主成分（PCA1）和第二主成分（PCA2）贡献率达64.82%，表明前2个主成分的特征解释了4个种质间约65%的差异。4个种质相分离，表明4个种质具有遗传差异性，其中，贞丰野生茶树与福鼎大白茶和龙井43号距离较远，表明野生茶树与栽培茶树遗传差异大；紫芽株系与绿芽株系距离较近，表明紫芽株系与绿芽株系遗传基础更接近。
2.6 贞丰野生茶树与福鼎大白茶和龙井43号的综合抗性和内含物质评估与比较
2.6.1 抗性指标和品质指标的层次聚类分析 所测指标中，叶脉对数、主脉厚度、叶面积、角质层厚度和海绵组织厚度与耐热性和抗旱性相关，叶片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度和栅栏组织厚度与抗旱性和抗寒性相关，栅海比和叶片结构组织紧密度则与抗寒性相关。根据指标与抗性间的相关性，通过分层聚类对各指标进行分析，选择相互独立且具代表性的指标做抗性分析。当聚为四大类时，指标的类间距较大，各类特点较突出，相关性较小（图4-A）。第Ⅰ类包主脉厚度、叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度，第Ⅱ类包括叶面积、上表皮厚度、叶脉对数、角质层厚度，第Ⅲ类为下表皮厚度，第Ⅳ类包括栅海比、叶片组织结构紧密度。
选择与光合作用、产量、次生代谢合成、分解和贮存相关的各项指标，包括叶面积、芽宽、芽宽/芽长、角质层厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、叶片厚度、芽长和栅海比等指标进行聚类分析，结果（图4-B）显示，当聚为三大类时，指标的类间距较大，各类特点较突出，相关性较小。第Ⅰ类包括叶面积、芽宽、芽宽/芽长、角质层厚度，第Ⅱ类包括栅栏组织厚度、海绵组织厚度、叶片厚度、芽长，第Ⅲ类为栅海比。
2.6.2 抗性指标和品质指标的筛选 计算得出各指标间的相关系数（表4），将相关系数和层次聚类中某指标所在类的指标个数带入相关指数计算公式=Σ/（-1）。相关指数决定各类代表性指标的选择，指数越大，代表性越强。由表5可知，与抗性相关的指标中，第Ⅰ类的主脉厚度相关指数最大，可作为此类的代表指标；第Ⅱ类的叶面积相关指数最大，可作为此类的代表指标；第Ⅲ类的下表皮厚度为单独指标；第Ⅳ类的栅海比和叶片组织结构紧密度2个指标的相关指数相等，但种质间栅海比最大差异值为0.18，远大于叶片组织结构紧密度的最大差异值0.05，因此，选择栅海比为代表指标更合适。由表6可知，与内含物质相关的指标中，第Ⅰ类的芽宽相关指数最大，可作为此类的代表指标；第Ⅱ类的海绵组织厚度相关指数最大，可作为此类的代表指标；第Ⅲ类的栅海比为单独指标。
2.6.3 叶片形态特征、解剖结构特征与其综合抗性和品质的隶属函数分析 基于综合抗性相关指数筛选出与抗性相关的4项代表指标，以及品质相关指数筛选与内含物质相关的3项代表指标，应用隶属函数值法对4个种质的综合抗性和品质进行评价，计算结果见表7和表8。由表7可知，抗性代表指标的隶属函数平均值排序依次为绿芽株系（0.4743）＞紫芽株系（0.4618）＞福鼎大白茶（0.4312）＞龙井43号（0.3858）。由表8可知，内含物质代表指标的隶属函数平均值排序依次为绿芽株系（0.4599）＞紫芽株系（0.4325）＞福鼎大白茶（0.4290）＞龙井43号（0.3888）。上述结果表明，贞丰野生茶树综合抗性强，内含物质丰富，绿芽株系的品质和抗性优于紫芽株系。
3 讨论
本研究对贵州贞丰地区野生茶树、国家级良种福鼎大白茶和龙井43号的芽长、芽宽、叶面积和节间长等22项指标进行测量、比较和分析，发现野生茶树资源综合抗性更强，内含物质更丰富，可作为优异种质资源进行开发和利用。
3.1 贞丰野生茶树与栽培品种的遗传差异性分析
野生茶树具有遗传多样性，是茶树品种创新的来源。抗性强、特异性成分突出的野生茶树资源是开展品种改良的基础，已成为近年来茶产业发展的重要手段（金基强等，2021）。形态学性状的鉴定和描述是种质资源研究最直接、最基本的方法和途径（郁香荷等，2011）。对绿芽株系、紫芽株系、福鼎大白茶和龙井43号共4个种质的22个检测指标进行主成分分析，结果发现绿芽株系和紫芽株系与福鼎大白茶和龙井43号在形态学上差异巨大，但在野生茶树内差异较小，表明野生茶树与栽培品种的遗传距离较大，与Niu等（2019）对贵州古茶树的遗传结构分析结果一致。芽宽、节间长、叶面积、气孔数、叶色、叶片质地、叶片厚度、角质层厚度、栅栏组织厚度、上表皮厚度、主脉木韧比和叶脉对数等指标是野生茶树与栽培型茶树遗传差异最显著的农艺性状，其与光合能力、干物质含量和品质性状密切相关（王守生等，2002；农玉琴等，2020；Kodikara et al.，2020）。上述结果表明，野生茶树在抗性和内含物质方面与栽培品种差异显著，且野生茶树群体内部存在遗传差异性，其中绿芽株系在营养生长方面更具有优势。
3.2 贞丰野生茶树综合抗性评价
形态学特征和解剖学结构与抗性显著相关（张玉叶等，2021）。茶树芽叶表面茸毛密度越大，抗病虫害能力就越强（尹鹏等，2016），绿芽株系和紫芽株系芽叶表面茸毛浓密，密度远远大于福鼎大白茶和龙井43号，表明野生茶树抗虫能力强。叶片角质层可有效防止水分散失，对细胞的受冻、解冻起着缓冲作用，角质层越厚，植物抗旱、抗寒和耐热的能力越强（Ben Salem-Fnayou et al.，2011；王烟霞等，2021）。相同面积叶片气孔数量越多，散热能力越强（孟庆杰等，2004）。叶脉对数和主脉厚度影响植物体内水分和营养物质的运输效率，叶片的叶脉对数越多，主脉越厚，表明植物对水分控制能力和抗旱耐热能力越强（梁文斌等，2010）。本研究中野生茶树的角质层厚度、气孔数量、叶脉对数和主脉厚度显著多于或厚于福鼎大白茶和龙井43号，表明野生茶树抗旱、抗寒和耐热能力更强。叶片表皮、栅栏组织厚度和叶片组织结构紧密度与植物逆境适应性呈正相关，与抗寒性也具有一定关系（刘梦颖和刘光立，2018；郭文文等，2020）。本研究中野生茶树的上、下表皮均显著厚于福鼎大白茶和龙井43号，绿芽株系的栅栏组织显著厚于福鼎大白茶和龙井43号，而紫芽株系的栅栏组织厚度、绿芽株系和紫芽株系的叶片组织结构紧密度介于福鼎大白茶和龙井43号之间，即野生茶树在以叶片组织结构紧密度为特征的抗性指标上弱于福鼎大白茶，但强于龙井43号，紫芽株系以栅栏组织厚度为特征的抗性指标上也介于2个国家级良种之间。尽管如此，分析表明，野生茶树的综合抗性显著高于福鼎大白茶和龙井43，表明贞丰野生茶树可作为提供抗性基因的优异种质资源。
3.3 贞丰野生茶树品质及适制性评价
茶树芽和叶是茶树进行光合作用、代谢物质合成与贮存的重要场所。芽和叶的形态学和解剖学特征能反映茶叶品质成分含量，是鉴定茶叶品质性状的重要手段（王飞权等，2019）。芽头是高级绿茶的原料，芽宽、芽长及其比值与芽头肥瘦、芽头品质成分含量成正比。芽叶茸毛富含茶氨酸和咖啡碱，也是茶叶毫香的来源（郭桂义等，2011；宋亚康等，2017）。本研究中贞丰野生茶树的芽宽、芽长及其比值均显著大于福鼎大白茶和龙井43号，且全芽覆盖浓密茸毛，表明野生茶树芽头肥壮，内含物质丰富，是做高档翠芽茶的优质原料。李家华和朱力图（2021）认为叶面积为40～60 cm的茶树为大叶种。紫芽株系和绿芽株系平均叶面积分别为40.27和52.87 cm，均为大叶种群体种株系。绿芽株系的平均叶面积是紫芽株系的1.31倍，表明绿芽株系的代谢物质比紫芽株系更丰富。栅栏组织中叶绿体较多，液泡较小，而海绵组织则相反（李娟等，2008）。叶绿体中富含类胡萝卜素，在茶叶加工过程中，类胡萝卜素裂解为α-/β-紫罗酮、二氢海葵内酯、大马士酮、茶螺烯酮等重要的香气物质（傅秀敏等，2021）。液泡是贮存茶多酚的场所，海绵组织越厚，液泡体积越大，茶多酚含量则越高，反之亦然。野生茶树的海绵组织均厚于福鼎大白茶和龙井43号，表明野生茶树茶多酚含量较高，适制性范围比福鼎大白茶和龙井43号更广。绿芽株系的栅栏组织显著厚于其他三种株系，紫芽株系介于福鼎大白茶和龙井43号之间，表明绿芽株系类胡萝卜素香气前体物质含量最丰富，紫芽株系类的胡萝卜素含量可能低于福鼎大白茶、高于龙井43号。陈岱卉（2009）、覃秀菊等（2009）认为，栅栏组织在2～3层、厚75～125 μm、栅海比高于0.5且上表皮较厚的茶树品种，在乌龙茶做青过程中有利于叶缘损伤和做青工艺的开展。而本研究结果显示，绿芽株系具有3层栅栏组织，均厚82.09 μm，栅海比0.98，上表皮均厚20.33 μm，表明绿芽株系还适合加工乌龙茶。综合各种品质性状代表指标，隶属函数值计算结果显示，绿芽株系内含物质含量明显高于其他3个种质，其次为紫芽株系，表明贞丰野生茶树内含物质丰富，推测是娘娘茶醇和口感与馥郁香气的物质基础。
4 结论
通过对22项形态学特征和叶片解剖结构指标进行分析发现，在综合抗性、品质和适制性方面，贞丰野生茶树优于福鼎大白茶和龙井43号，绿芽株系优于紫芽株系。贞丰野生茶树绿芽株系具有选育优异种质资源的潜力。