大豆肽酶解条件与抗氧化性关系的研究
《牡丹江大学学报》 2021年7期
作者：温 睿
（牡丹江大学医护学院，黑龙江 牡丹江 157011）
自由基在人体产生过多或清除过慢时，其通过攻击生命大分子物质和各种细胞，加速机体衰老并诱发多种疾病。[1]获取天然、安全、高效的抗氧化剂成为当前研究的热点。[2]大豆肽是大豆蛋白的水解产物。大豆肽的氨基酸组成几乎与大豆蛋白质的相同，必需氨基酸模式平衡良好、含量丰富。大豆肽具有多种生理活性。本研究采用二苯代苦味酰基自由基消除率测定方法，固定大豆肽酶解条件中四种因素变化其中一种因素来研究其酶解条件与抗氧化性的关系，为大豆肽的开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
1.1.1 材料与试剂
大豆；Alcalase碱性蛋白酶；二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）；氢氧化钠；盐酸；硫酸；硫酸钾；硫酸铜；三氯乙酸；福林-酚试剂。
1.1.2 仪器与设备
微电脑电磁炉；电子分析天平；远红外分析仪；722型分光光度计；快速混合器；双螺杆挤压机；高速万能粉碎机；恒温水浴锅；JJ-1增力电动搅拌器；酸度计；离心机； 蛋白质测定仪。
1.2 试验方法
1.2.1 大豆肽的制备
采用酶法制备大豆肽。[3]市售大豆先经挤压膨化，再粉碎，然后准确称取豆粉50g。称取适量的水，加入豆粉中，配制成一定浓度的料水比溶液，置于恒温水浴锅中开始搅拌，调节温度，调节pH值，加入适量的Alcalase碱性蛋白酶进行恒温酶解，在此过程中需要不断进行搅拌，同时需用1N的氢氧化钠溶液通过滴加来维持反应体系pH值的恒定（偏差控制在±0.1）。达到设定酶解时间后，取出酶解液在4500r/min的离心机中离心20min。离心后，将顶层漂浮油脂小心倾倒撇去，收集中层清液，在中层清夜中滴加10%三氯乙酸调节其pH至4.3（大豆蛋白等电点），然后将酶解液放入沸水浴，水浴10min使酶活力丧失，在4500r/min低温离心机中离心20min，倾倒出上清液，除去底层沉淀物，即未水解大豆蛋白和其它非溶性物质，记录上清液总体积，将其装入塑料小瓶中置于4℃冷藏保存。取部分上清液测蛋白质含量，利用公式（2）计算TCA-NSI值；记录NaOH溶液的滴加量，利用公式（1）pH-stat法计算水解度。
（1）VNaOH—消耗碱液的体积（ml）；
NNaOH—消耗碱液的的摩尔浓度（mol/L）；
α-为α-氨 基 解 离 度，1/α=l+l0(pH-pK)，其中pK为α-氨基的平均pK， pH为反应起始的pH值；
Mp—底物蛋白质的总量（g）
Htot—单位质量蛋白中的肽键总和（mmol/g），对于某一特定的蛋白质来讲Htot是一个常数，大豆蛋白Htot=7.75mmol/g。
大豆肽的计算公式
取酶解上清液，加入等量的10%的三氯乙酸（TCA）溶液，混合震荡30min，然后离心分离20min（4500rpm），测上清液可溶性氮，计算氮溶指数，也是肽得率。
（2）TCA-NSI—三氯乙酸可溶性氮得率（%）；
N1—在10% TCA中可溶性氮（mg）；
N2—样品中总的氮含量（mg）。
1.2.2 大豆肽对二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）清除能力的测定方法[4]
DPPH·是一种以氮为中心的很稳定的自由基，其乙醇溶液为深紫色，它在可见光区最大吸收峰为517nm。在DPPH溶液中加入抗氧化剂时，其颜色变浅，变浅程度与抗氧化剂对自由基的清除能力呈线性关系。因此可用于评价天然抗氧化剂清除自由基的能力。[5]
准确取大豆肽酶水解物1.00mL，加入4.00mL的100μmol/L DPPH乙醇溶液混匀，避光放置30min，以原溶剂调零，在517nm处测定吸光度记为Ai；同法取1.00mL溶剂加入4.00mLDPPH溶液混匀，测定吸光度记为Ac；取1.00mL水解物加入4.00mL的溶剂混匀，测定吸光度记为Aj。计算公式为：自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100% 。
2 结果与分析
2.1 大豆肽酶解条件与抗氧化性的关系
2.1.1 大豆肽对二苯代苦味酰基自由基消除率与水解时间的关系
在温度57℃，酶解时间4h，料水比1/6，pH9.5的酶解条件下，变化酶解时间为1.5h、2.5 h、3.5 h、4.5 h、5.5h， 研究自由基消除率与酶解时间的关系。
图1显示：随着酶解时间的延长，肽得率和大豆肽对自由基的清除率都升高，大豆肽对自由基的清除率在4.5h时达到最高33.09%，超过4.5h后呈下降趋势。
图1 二苯代苦味酰基自由基消除率和肽得率随水解时间变化曲线Fig1 Time of hydrolysis affects on the capability of acyl-diphenyl bitter scavenging rate and peptide yield
由图1可知，抗氧化性和肽得率在水解前期变化比较一致，随着水解时间的增加，抗氧化活性不断的提高，达到最高值后，继续延长水解时间，大豆肽抗氧化活性逐渐降低，而肽得率在抗氧化活性达到最高值后稍有升高。原因可能是蛋白酶是逐步水解蛋白质的，当蛋白酶量和底物一定的情况下，蛋白质通常被逐步水解为较小的肽段，而具有强自由基消除率的肽段一般是具有特定氨基酸残基的，随着水解时间的延续，具有强自由基消除率的肽段可能将被从蛋白质序列上水解下来，然后进一步水解为氨基酸，而导致部分抗氧化活性消失。
2.1.2 大豆肽对二苯代苦味酰基自由基消除率与加酶量的关系
在温度57℃，酶解时间4h，料水比1/6，pH9.5的酶解条件下，变化加酶量（U/g）4800、9600、14400、19200和24000，研究自由基消除率与加酶量的关系。
图2显示：随着酶用量的加大，肽得率和自由基消除率均呈先上升趋势，当酶用量达19200U/g时对自由基的清除率最高，效果最优。而肽得率在抗氧化性达到最高值后稍有增加。随着加酶量的增加，水解度不断提高，蛋白酶的浓度决定底物的水解度，只有当酶分子在该体系中趋于或者达到饱和后，部分酶分子不能再与底物接触时，水解度变化趋势趋于降低。随着加酶量的增加，大豆肽的肽得率也随着增加，水解物的分子量的分布范围就会越小，而水解物只有在一定的分子量范围时才表现较高的抗氧化活性，水解不足或过度水解等都使其水解物的抗氧化活性降低。
图2 自由基消除率和肽得率随加酶量变化曲线Fig2 The contents of protease affects on the elimination rate of free radicals and peptide yield
2.1.3 大豆肽对二苯代苦味酰基自由基消除率与pH值的关系
在温度57℃，酶解时间4h，料水比1/6，加酶量1.7%的酶解条件下，变化pH值7.5、8、8.5、9、9.5、10，研究自由基消除率与pH值的关系。
由图3可知：随着水解液pH值的增大，肽得率和自由基消除率都呈上升趋势，当pH值达到9.0时，肽得率和自由基消除率达到最大值，接着随着pH值的升高而降低。在pH值为9.0时，对自由基的清除率在达到最高为33.85%，效果最优。酶蛋白发挥其催化效能需要保持一定的空间构象，大豆的解离状态随pH值的变化而变化。这些变化也影响了酶分子的特殊构象。大豆蛋白作为反应体系中的底物随pH的变化也呈现出不同的解离状态。所以pH值能直接影响酶与蛋白底物的结合以及催化。
图3 自由基消除率和肽得率随pH值变化曲线Fig3. The pH affects on the elimination rate of free radicals and peptide yield
2.1.4 大豆肽对二苯代苦味酰基自由基消除率与温度的关系
在pH值9.5，酶解时间4h，料水比1/6，加酶量1.7%下的酶解条件下，变温度50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下研究自由基消除率与温度的关系。
由图4可知，随着温度升高，肽得率和自由基消除率都呈上升趋势，当温度达到60℃时，自由基消除率和肽得率都达到最大值，接着随着温度的升高而降低。在温度为60℃时，自由基消除率最高为33.43%。
图4 自由基消除率和肽得率随温度变化曲线Fig4 The temperature affects on the elimination rate of free radicals and peptide yield
各种催化反应都有最适的温度，因为在酶的最适温度下反应才会进行的很快，环境的温度对酶的作用非常显著，酶催化反应的温度既影响化学反应速度，又能影响酶蛋白的热稳定性。温度对肽得率和自由基消除率的影响很明显，从图中可看出，在最适合的温度范围55℃-65℃之间，肽得率和自由基的消除率都成较大值状态，不在这个温度范围内，偏大或者偏小的温度都很显著的使这两个指标降低。
2.1.5 大豆肽对二苯代苦味酰基自由基消除率与料水比的关系
在pH值9.5，酶解时间4h，温度57℃，加酶量1.7%的酶解条件下，变料水比1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7下研究自由基消除率与料水比的关系。
图5中显示随着料水比的加大，肽得率和自由基消除率均呈上升趋势，在料水比1/6时，肽得率和自由基消除率都达到最大值。在料水比1/6时，自由基消除率达到最大为34.04%，之后呈下降趋势。
图5 自由基消除率和肽得率随料水比变化曲线Fig5 Power to water affects on the elimination rate of free radicals and peptide yield
当水的比例较低时，料—底物相对较浓，空间位置较为拥挤，其底物就不足与所有的酶都结合，也存在一部分游离的酶未结合到底物，从而很多酶都没有发挥到催化作用。因此产物的生成速度就比较低。但是随水的比例增加，很多底物的空间位置越来越宽敞，而使得很多酶更充分的与底物相接触，反应加快，产物也越来越多，肽得率和自由基消除率都呈上升趋势，生成的大豆肽也就越多，对自由基的消除率也就越大。但当所有的酶都结合了底物后，反应速度就达到饱和状态，这种情况下即使水的比例再增加，反应也还是处于零级反应状态，肽得率不会增加，或者逐渐下降，大豆肽生成没有很大变化，所以其抗氧化性也不会增加，自由基的消除率也变化不大。
3 结果与讨论
本研究以酶解大豆肽的抗氧化性为研究对象，以二苯代苦味酰基自由基消除率为指标，固定大豆肽酶解条件中四种因素变化其中一种因素来研究其酶解条件与抗氧化性的关系。试验结果表明大豆肽对二苯代苦味酰基自由基的清除率在水解4.5h时达到最高33.09%、在pH值为9.0左右时达到最大为33.85%、在温度为60℃时达到最高为33.43%、在料水比1/6时，自由基消除率达到最大为34.04%。在水解的初期，大豆肽的抗氧化活性随肽得率的增加而增加，达到一定值时，随着肽得率的增加而减少；大豆肽的酶解条件中温度、pH值、料水比在肽得率达到最大时，其抗氧化性也达到最大；大豆肽的酶解条件中酶解时间、加酶量在抗氧化性达到最大时，肽得率并没有达到最大，而是之后稍有增加再减少，这说明抗氧化活力可能与肽中氨基酸排序以及肽链的长度有关。