翰墨点睛：贵州良工宝
栏头合书推介：惠民、乔杨
国土名片网钤印：王子廬
插播导读：国土名片网小编芬儿、新宇、张扬、李浩
影响不同酱香酒总多酚含量的因素探讨
《中国酿造》杂志 2020年1期
作者：何 菲，先 春
（1.仁怀酱香白酒科研所，贵州 仁怀 564500；2.贵州省产品质量监督检验院 仁怀分院，贵州 仁怀 564500）
酿造酱香型白酒小麦中含有微量阿魏酸[1-2]，糯高粱中含有丰富的单宁物质[3]，发酵过程中在微生物酶等诸多因素影响下逐步转化为难挥发的多酚、半挥发性酚和挥发性酚，赋予了酱香型白酒独特香气和口味感官特征[4]。
由于这些酚类物质中含有一个或多个酚羟基，具有一定的抗氧化作用和风味贡献，一直是酒界热议的话题[5-6]。白酒的国内外研究中，利用色谱类仪器检测出了18种挥发性酚类物质，如愈创木酚、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚等[7-9]；11种半挥发性酚类物质，如香草醛、对羟基苯乙酮、水杨酸等[10]；27种难挥发的多酚类化合物，如没食子酸、二氢黄酮、阿魏酸、槲皮素、杨梅酮等[11-13]。利用福林-酚法直接测定酱香酒的酚类总量及其变化规律等内容则鲜有报道。
本研究利用酚类物质在碱性条件下具有还原性，可将福林酚试剂中的磷钨钼酸还原成蓝色，蓝色深浅与酚类物质的含量成正相关性原理[14]，利用分光光度计在最大吸收波长下测定酱香型白酒中总多酚含量，选用没食子酸作标准对照品计算其总含量，探讨分析不同酱香基酒和成品酒中总多酚的变化规律以及影响因素，并运用IBM SPSS Statistics 25.0进行单因素方差分析，以期为今后的研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 酒样的收集
仁怀大曲酱香轮次基酒的采集。收集最近3年贵州仁怀境内按照一年一个生产周期、两次投粮、九次蒸煮、八次发酵、七次摘酒的传统大曲酱香工艺生产的666个一至七轮次基酒（原酒），详见表1。
表1 仁怀大曲酱香轮次基酒实验样本信息Table 1 Experimental samples information of Renhuai Daqu sauce-flavor rounds base liquor
不同产地酱香工艺成品酒的采集。收集2018年出厂贵州仁怀境内生产的传统大曲酱香成品酒和其他非传统大曲酱香成品酒201个酒样；市场上，随机购买2018年出厂的12个非仁怀区域生产的酱香成品酒。详见表2。
表2 不同产地酱香成品酒实验样本信息Table 2 Experimental samples information of sauce-flavor Baijiu from different producing areas
1.1.2 药品与试剂
没食子酸标准品（CAS：149-91-7，纯度≥99.00%）：贵州迪大生物科技有限责任公司；乙醇（色谱纯）：默克股份两合公司；钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂（均为分析纯）：天津市津科精细化工研究所；溴水（Br2=3%，分析纯）、磷酸（H3PO4≥85%，分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；盐酸（36%～38%，分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；无水碳酸钠（分析纯）：天津市光复科技发展有限公司。
1.2 仪器与设备
TU-1901型双束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；BS 244S 电子天平：北京塞多利斯仪器系统有限公司；10～100 μL、100～1 000 μL、1～10 mL移液器：艾德本（中国）有限公司；BWS-0510恒温水槽与水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；DK-98-11电子调温万用炉：天津市泰斯特仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 标准溶液的配制
没食子酸储备液（100 mg/L）：精密称取0.005 0 g（精确至0.000 1 g）没食子酸标准品，用体积分数为60%vol的乙醇溶液溶解、定容至50 mL，4.0 ℃以下贮存。
没食子酸标准曲线工作溶液：准确吸取没食子酸储备液1.60 mL于10 mL容量瓶中，用体积分数为60%的乙醇溶液定容，得到16.0 mg/L标液，然后依次吸取5.00 mL高浓度标液于10 mL容量瓶中，用体积分数60%的乙醇溶液定容，依次得到16.0 mg/L、8.0 mg/L、4.0 mg/L、2.0 mg/L、1.0 mg/L、0.5 mg/L和0.0 mg/L的没食子酸标准工作溶液，现配现用。
1.3.2 试剂的配制
福林-酚（Folin-phenol）显色试剂：分别称取钨酸钠25.00 g（精确至0.01 g）、钼酸钠6.25 g（精确至0.01 g）于200 mL水中，完全溶解后转入500 mL磨口三角瓶中，分别加入12.5 mL磷酸和25.0 mL盐酸，搅拌混匀后置于100 ℃水浴锅中回流2 h，再加入硫酸锂37.50 g（精确至0.01 g）、适量的水和数滴溴水，敞开置于电炉上使其沸腾15 min，使其溴水完全挥发；冷却转入500 mL容量瓶中定容，0.45 μm滤膜过滤后转入棕色瓶中备用[15]。
碳酸钠溶液（75 g/L）：称取无水碳酸钠37.50 g（精确至0.01 g）溶于250 mL温水中，搅拌混匀后转入500 mL容量瓶中定容，0.45 μm滤膜过滤后置于常温下备用[15]。
1.3.3 样品的处理与计算
样品测定条件的摸索：吸取两个不同质量浓度没食子酸溶液（标样01和标样02）和两个不同轮次基酒（酒样01和酒样02）1.0 mL，加入1.0 mL福林-酚显色剂，振荡后静置3～5 min后，再加入8.0 mL 75 g/L碳酸钠溶液后，在波长765 nm条件下扫描没食子酸溶液（扫描间隔0.5 min）；随后扫描酒样（没食子酸标样溶液）在400～900 nm范围内的最大吸收波长（扫描波长间隔1 nm）[16]。
样品含量的测定过程：吸取2.0 mL酒样（或标准溶液）于25 mL比色管中，加入1.0 mL福林-酚显色剂，振荡后静置3～5 min后，再加入7.0 mL 75 g/L碳酸钠溶液，振荡后静置30.0 min后处理液经0.45 μm微孔滤膜过滤取过滤液（或经3 000 r/min离心5 min取上清液），在波长760 nm处测定其吸光度值，根据标准溶液浓度与吸光度值计算酒样中总多酚的含量（以没食子酸含量计）。
2 结果与分析
2.1 检测方法的确认
2.1.1 样品取样量、检测波长、显色时间的确认
图2 酒样（没食子酸溶液）波长扫描曲线Fig.2 Spectral scanning curve of Baijiu samples (gallic acid solution)
由酒样（标样）处理液显色时间扫描曲线（图1）可知，酒样01和酒样02显色30 min后溶液的吸光度值趋于平衡稳定，标样01和标02显色30 min后吸光度值缓慢下降，实验确定处理液显色30 min后立刻测定标准溶液的吸光度值，随后测定酒样的吸光度值。由酒样（标样）处理液光谱扫描曲线（图2）可知，在波长400～900 nm扫描范围内，酒样01、酒样02、标样01、标样02在波长760 nm左右吸光度值达到顶峰，实验确定测定标样（酒样）的波长为760 nm。
2.1.2 标准曲线与线性相关性
配制7个不同浓度梯度的没食子酸标准溶液，处理后显色30 min后，在波长760 nm处测定标准溶液的吸光度值，先用2 cm比色皿盛空白溶液校零。以质量浓度（C）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标建立标准曲线。其标准曲线回归方程为A=0.0621C-0.001，相关系数R2=1.000 0，说明线性相关性较好。
2.1.3 方法精密度与准确度
没食子酸标准溶液精密度试验结果见表3。从表3可看出，平行试验6次没食子酸溶液的测定结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.15%～1.53%，表明精密度良好，满足相关技术要求。
表3 福林酚法的精密度试验结果Table 3 Precision tests results of Folin-phenol method
2.1.4 样品加标回收率
准确吸取样品2.0 mL于18支具塞比色管中，分成3个浓度组，每组分别添加1.026 mg/L、2.052 mg/L、5.130 mg/L没食子酸标准溶液，按照上述方法测定其吸光度值，进行6水平试验计算其回收率，结果见表4。从表4可看出，在选定的酒样中成倍加入没食子酸标准溶液后，回收率分别为99.19%、101.53%和101.60%，回收率在90%～110%范围内，表明准确度良好，满足相关技术要求。
表4 福林酚法的加标回收率试验结果Table 4 Results of standard recovery rate tests of Folin-phenol method
通过以上方法试验（标准曲线、方法精密度、方法准确度、方法回收率）的确认，各项参数均满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》标准的附录要求，说明该方法准确可靠[17]。
2.2 总多酚随传统工艺基酒轮次的变化比较
收集最近3年（2015-2016年度、2016-2017年度、2017-2018年度）仁怀境内传统酱香工艺生产的666个仁怀大曲酱香一至七轮次基酒测定其总多酚含量，利用IBM SPSS Statistics 25.0统计软件进行单因素方差分析。以基酒的轮次作为因子，总多酚含量作为因变量进行组间两两比较（表5），并绘制出波动的箱线图（图3）。
由表5可知，通过仁怀传统大曲酱香轮次基酒总多酚的组间两两比较发现，同类子集分析显示除一轮次基酒和二轮次基的总多酚含量无明显差异外，其他三轮次基酒、四轮次基酒、五轮次基酒、六轮次基酒、七轮次基酒的总多酚含量存在明显差异。结合同类子集组间均值和箱线图（见图3）分析，总多酚的含量随着基酒轮次的增加呈上升趋势，除一、二轮次基酒变化不明显外，其他轮次基酒总多酚含量呈现明显的上升趋势。
表5 仁怀大曲酱香轮次基酒总多酚含量的比较Table 5 Comparison of total polyphenols content in Renhuai sauce-flavor base liquor from different rounds mg/L
图3 总多酚随轮次变化的箱线图Fig.3 Box plot of total polyphenols with rounds changes
通过调研发现，仁怀本地酿酒企业按照TB52/RHJX 002—2015《仁怀大曲酱香酒生产技术规范》标准选用富含单宁的本地优质糯高粱和小麦制得的高温大曲作为主要酿造原料酿制生产取得一至七轮次基酒，其中特别要求高粱的单宁含量＞1.0%[18]。这些单宁物质主要存在于高粱的果皮中，而发酵堆中的单宁酶能水解没食子单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和其他化合物[19]；同时，酿酒高粱果皮中含有丰富的游离态酚酸（如阿魏酸、丁香酸、没食子酸等）和结合态酚酸（如阿魏酸、丁香酸等）[20]；另外，小麦麸皮中还含有微量的酚类物质，小麦原料经热处理后酚类成分直线上升，其中以阿魏酸、香兰醛、香兰酸等为主[1]。又由于酱香传统工艺采用循环发酵的模式进行蒸馏取酒[18]，逐渐将原料果皮（麸皮）中酚类物质酶解转化到酒醅中，使得基酒中的总多酚含量随着轮次的循环逐渐升高。
2.3 不同来源酱香酒总多酚的差异比较
收集（购买）仁怀境内生产201个不同酱香工艺的成品酒和非仁怀境内生产12个具有代表性的酱香酒测定其总多酚含量，利用IBM SPSS Statistics 25.0统计软件进行单因素方差分析。以工艺（产区）作为因子，总多酚含量作为因变量进行组间两两比较（表6），并绘制出波动的箱线图（图4）。
表6 不同来源酱香成品酒总多酚含量的比较Table 6 Comparison of total polyphenols in sauce-flavor Baijiu from different sources mg/L
图4 不同工艺（产区）来源酱香成品酒总多酚箱线图Fig.4 Box plot of total polyphenols in sauce-flavor Baijiu from different sources (producing areas)
由表6可知，通过不同来源酱香成品酒的总多酚的组间两两比较发现，子集2中仁怀境内生产的碎沙工艺酱香成品酒、串香工艺酱香成品酒和非仁怀境内生产的酱香成品酒之间的总多酚含量无明显的差异；仁怀境内生产的传统工艺酱香成品酒略高于子集2中成品酒的总多酚含量，而仁怀境内生产其他工艺酱香成品酒的总多酚含量明显低于子集2和子集3中成品酒的总多酚含量。
通过调研勾兑工序发现，仁怀传统工艺生产的酱香成品酒分别有一至七轮次基酒按一定的的比例勾兑调味后最终得到酱香成品酒[21]。一般情况下，勾兑时一至七轮次使用的比例依次分别为5%～10%、8%～15%、25%～35%、20%～30%、15%～20%、3%～10%、3%～10%，结合测定的一至七轮次基酒总多酚含量可发现，仁怀传统工艺酱香酒的总多酚直接受勾兑比例和轮次基酒总多酚含量多寡的影响。另外，为了避免碎沙工艺、串香工艺酱香成品酒单薄、寡淡的风格缺陷，勾兑师在这些工艺的半成品酒中加入传统工艺生产的一轮次基酒，使酒味甜，放香好；加入传统工艺生产的七轮次基酒，使酒的糊香好，只要不露头，也增加了后味[22]，而七轮次基酒的总多酚含量相对较高，这样直接导致仁怀境内生产的碎沙工艺、串香工艺酱香成品酒中总多酚含量的升高。
通过调研收集的214个酒样酿造原料和工艺现状发现，非仁怀境内生产的酱香成品酒使用的酿酒高粱的单宁相对仁怀本地糯高粱的单宁含量要低[23-24]；而仁怀传统工艺按照标准要求选用本地种植的优质糯高粱，单宁含量相对较高[25]；仁怀碎沙工艺多选用相对便宜的北方糯高粱，这类高粱通常单宁含量相对较低[26]；仁怀串香工艺酱香成品酒以食用酒精为原料，串蒸传统工艺8次发酵后的丢糟粗糙制得；仁怀其他工艺酱香酒则直接在食用酒精中添加香精香料，并加入少量过剩的传统工艺生产的一轮次基酒、七轮次基酒和窖底味酒，简单勾兑调味而成。从原料的使用情况看，原料中的单宁含量存在不同程度的差异，间接影响不同来源酱香成品酒中的总多酚含量。
3 结论
基于紫外吸光度值与酱香酒中总多酚含量的正比关系，在0.50～16.00 mg/L范围内没食子酸标准曲线的线性良好（R2=1.000），精密度试验结果RSD范围为0.15%～1.53%，加标回收率范围为99.19%～101.60%，说明样品处理过程时，总多酚的损失和变化可忽略不计，验证该方法准确可靠，适合用于测定酱香酒中的总多酚的含量。
通过同类子集比较结合生产调研分析，仁怀大曲酱香轮次基酒中的总多酚主要受原料中单宁等酚类物质含量和蒸煮发酵循环次数的影响，促使蒸馏取得的传统工艺轮次基酒的总多酚含量呈上升的趋势；另外，受勾兑和基酒的影响，仁怀传统工艺酱香成品的总多酚含量略高于别的酱香成品酒。通过分析测定酱香传统工艺轮次基酒和不同来源酱香成品酒中总多酚含量，可为酱香酒的勾兑调味和工艺（产区）识别提供数据参考。同时，为贮存时间、贮存环境、贮存容器等影响因素的探讨奠定基础。