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天麻苷元脂质体制备及药剂学性能研究*
《贵州医科大学学报》 2021年10期
作者团队：邱红燕，刘学，周雪，吴林菁，肖婷，茅向军，沈祥春***，陶玲***
(1.贵州医科大学 贵州省天然药物资源高效利用工程中心 & 贵州医科大学-贵阳市联合重点实验室 & 贵州省高等学校天然药物药理与成药性评价特色重点实验室 & 天然药物资源优效利用重点实验室， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州省食品药品检验所， 贵州 贵阳 550004)
天麻是兰科植物(GastrodiaelataBl.)的干燥块茎，天麻苷元(gstrodin)与天麻素(gastrodigenin)是天麻的主要有效成分，具有镇静、镇痛、抗癫痫、抗惊厥等药理作用[1-2]。目前，天麻素已有多种制剂被广泛用于头痛、眩晕等疾病的治疗，其药理作用的研究及其作用机制的探讨也逐渐趋于全面，而尚未见天麻苷元相关制剂在临床上应用。天麻苷元为对羟基苯甲醇，相对分子质量更小，具有脂水两亲性、跨膜能力较强以及更易进入脑内的特点。有研究指出，静脉注射相同剂量的天麻素及天麻苷元，后者脑脊液中的血药浓度-时间曲线下面积(area under curve，AUC)明显高于前者[3]。还有研究显示，天麻苷元极有可能是天麻素通过血脑屏障后留存在脑组织中发挥中枢作用的药效成分[4]。因此，近年来天麻苷元逐渐被人们所重视，是一个具有良好开发前景的药物。但是天麻苷元较难溶于水，口服生物利用度低，局限了其临床治疗效果的发挥[5-6]。脂质体作为一种新型药物载体，具有生物利用度高、生物相容性好、促进转运以及提高药物稳定性等优点[7-9]。本研究采用薄膜-超声分散法进行天麻苷元脂质体制备，采用超滤离心法进行天麻苷元脂质体包封率的测定，并以包封率(entrapped efficiency，EE)、平均粒径、粒径范围和多分散指数(polydispersity index，PDI)为评价指标进行单因素实验的考察，筛选出天麻苷元脂质体的最佳制备工艺。
1 材料与方法
1.1 实验仪器与试药
Waterse2695型高效液相色谱仪(美国沃特世公司)、NANOJ H10型高速剪切乳化机(ATS工业系统有限公司)、HB ECO S096型旋转蒸发仪(德国IKA公司)、KQ-300DE型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、ME104/02型电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]、UPW-UP-10型纯水仪(成都天莘宁科技有限公司)、AH-NANO型高压均质机(ATS工业系统有限公司)、LF-1型脂质体挤出器(AVESTIN公司)、NANO-ZS型粒度及Zeta电位测定仪(英国马尔文仪器有限公司)。天麻苷元(纯度>98%，批号P1372734，Adamas试剂有限公司)、大豆磷脂(批号201908012，上海太伟药业股份有限公司)、胆固醇(批号20200325，国药集团化学试剂有限公司)、乙腈(色谱纯，美国Tedia试剂公司)、甲醇(色谱纯，美国Tedia试剂公司)、水为实验室一级水，其他试剂试药均为分析纯。
1.2 研究方法
1.2.1色谱条件 采用Ultimate®AQ-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇 ∶水=5 ∶95，检测波长220 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL。
1.2.2溶液的制备 称取天麻苷元对照品13.14 mg，甲醇超声溶解并定容至50 mL，再吸取1 mL置于50 mL量瓶中，甲醇定容，得浓度为5.256 mg/L的天麻苷元对照品溶液。吸取按照最优处方制备的脂质体溶液0.1 mL置棕色量瓶中，甲醇适量，超声，定容至100 mL，摇匀，即得天麻苷元脂质体供试品溶液。同法制备空白脂质体溶液。
1.2.3专属性 取上述对照品溶液及供试品溶液、空白脂质体溶液适量，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，按“1.2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。
1.2.4方法学考察 (1)线性关系考察：吸取“1.2.2”项下天麻苷元对照品溶液4、8、12、16、20 μL，注入高效液相色谱仪，按“1.2.1”项下色谱条件进行测定；(2)精密度试验：取对照品溶液(5.256 mg/L)，经0.22 μm微孔滤膜滤过，按“1.2.1”法连续测定6次，记录峰面积，计算峰面积的RSD值；(3)重复性试验：吸取脂质体6份，按“1.2.2”项下方法处理天麻苷元脂质体，并按“1.2.1”法进样测定，记录峰面积，计算峰面积的RSD；(4)稳定性试验：吸取脂质体1份，按“1.2.2”项下方法处理天麻苷元脂质体，别在 0、2、4、6、8、12以及24 h进样，按“1.2.1”项下色谱条件进行测定并记录峰面积，计算峰面积的RSD值；(5)加样回收率试验：吸取天麻苷元脂质体6份适量，分别加入等量的天麻苷元对照品，按“1.2.2”项下方法处理天麻苷元脂质体，按“1.2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，带入线性方程，计算其平均回收率和RSD值。
1.2.5EE的测定[10-13]取天麻苷元脂质体3 mL于超滤管(50 kDa)中，4 000 r/min离心10 min，取续滤液适量置于10 mL量瓶中，甲醇定容，按“1.2.1”项下色谱条件进样测定，计算得游离药物含量(W游)。取0.1 mL天麻苷元脂质体溶液于10 mL量瓶中，甲醇定容，按“1.2.1”项下色谱条件进样测定，为天麻苷元脂质体中的含药量(W总)。根据下列公式计算EE，EE%=(W总-W游)/W总×100%。
1.2.6天麻苷元脂质体的制备 参考文献[14-18]和预实验结果，确定通过以下单因素实验进行处方和工艺优化。(1)天麻苷元与大豆磷脂质量比例的考察，固定胆固醇与大豆磷脂的质量比为1 ∶4，50 ℃旋蒸30 min，用超纯水10 mL作为水合介质，50 ℃水合30 min，50 ℃超声10 min，10 000 r/min高速剪切3 min，依次过0.8、0.4、0.1 μm滤膜各3次，以EE、平均粒径、粒径范围和PDI作为天麻苷元脂质体的评价指标，考察天麻苷元与大豆磷脂的比例为1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5 对制备天麻苷元脂质体的影响；(2)胆固醇与大豆磷脂质量比例的考察，固定天麻苷元与大豆磷脂的质量比为3 ∶1，50 ℃旋蒸30 min，用超纯水10 mL 作为水合介质，50 ℃水合30 min，50 ℃超声10 min，10 000 r/min高速剪切3 min，依次过0.8、0.4、0.1 μm滤膜各3次，以EE、平均粒径、粒径范围和PDI作为天麻苷元脂质体的评价指标，考察胆固醇与大豆磷脂比例为3 ∶1、4 ∶1、5 ∶1对制备天麻苷元脂质体的影响；(3)旋蒸温度的考察，固定天麻苷元与大豆磷脂的质量比为1 ∶3，大豆磷脂与胆固醇质量比为3 ∶1，旋蒸时间为30 min，用10 mL 超纯水作为水合介质，50 ℃水合30 min，50℃超声10 min，10 000 r/min高速剪切3 min，依次过0.8、0.4、0.1 μm滤膜各3次，以EE、平均粒径、粒径范围和PDI作为天麻苷元脂质体的评价指标，考察旋蒸温度40、50以及60 ℃对制备天麻苷元脂质体的影响；(4)水合温度的考察，固定天麻苷元与大豆磷脂的质量比为1 ∶3，胆固醇与大豆磷脂质量比为1 ∶3，50℃旋蒸30 min，用10 mL 超纯水作为水合介质，水合时间为30 min，50℃超声10 min，10 000 r/min高速剪切3 min，依次过0.8、0.4、0.1 μm滤膜各3次，以EE、平均粒径、粒径范围和PDI作为天麻苷元脂质体的评价指标，考察水合温度为40、50以及60 ℃对制备的天麻苷元脂质体影响；(5)水合时间的考察，固定天麻苷元与大豆磷脂的质量比为1 ∶3，胆固醇与大豆磷脂质量比为1 ∶3，50 ℃旋蒸30 min，以超纯水10 mL 为水合介质，水合温度为50 ℃，50 ℃超声10 min，10 000 r/min高速剪切3 min，依次过0.8、0.4、0.1 μm滤膜各3次，以EE、平均粒径、粒径范围和PDI作为天麻苷元脂质体的评价指标，考察水合时间为15、30以及60 min对制备天麻苷元脂质体的影响；(6)过滤膜次数考察，固定天麻苷元与大豆磷脂的质量比为1 ∶3，胆固醇与大豆磷脂质量比为1 ∶3，50 ℃旋蒸30 min，以超纯水10 mL 为水合介质，50 ℃水合30 min，50 ℃超声10 min，10 000 r/min高速剪切3 min，采用脂质体挤出器，依次过0.8、0.4 μm滤膜各3次，以EE、平均粒径、粒径范围和PDI作为天麻苷元脂质体的评价指标，考察过0.1 μm滤膜次数3、5、7次对制备的天麻苷元脂质体影响。称量天麻苷元40 mg、胆固醇40 mg、豆磷脂120 mg置于15 mL EP管中，加入无水乙醇10 mL，超声3 min(功率300 W，频率40 kHz)使其充分溶解，转移至茄形瓶中，旋转蒸发仪40 ℃水浴减压蒸发去除有机溶剂。加入超纯水10 mL作为水合介质进行洗膜；40 ℃水浴下常压旋转水合30 min，50 ℃水浴超声10 min，10 000 r/min高速剪切3 min，再依次过0.8、0.4 μm滤膜各3次，0.1 μm滤膜7次；取续滤液，即得天麻苷元脂质体。
1.2.7最佳处方工艺条件下天麻苷元脂质体外观形态 根据单因素试验结果，得最佳处方工艺条件，观察最优工艺所制得天麻苷元脂质体的外观。
1.2.8最佳处方工艺条件下EE的测定 根据单因素试验结果，获得天麻苷元脂质体的最佳处方工艺条件，按“1.2.5”项下方法测定最优工艺条件所制得天麻苷元脂质体的EE。
1.2.9最佳处方工艺条件下粒径和PDI考察 根据单因素试验结果，得最佳处方工艺条件，采用纳米激光粒径分析仪测定最优工艺所制得天麻苷元脂质体的平均粒径、粒径范围和PDI。
2 结果
2.1 天麻苷元脂质体含量测定
专属性试验结果表明，天麻苷元对照品与天麻苷元供试品在色谱相应的位置上天麻苷元色谱峰保留时间一致，空白脂质体在天麻苷元相应出峰时间处无吸收峰，对测定无干扰，专属性强，见图1。以进样量(X，ng)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制天麻苷元标准曲线，即得回归方程为Y=3 597.90X+305.30(r=0.999 6)，表明天麻苷元在2.10～10.51 mg/L浓度范围内，线性关系良好；精密度试验峰面积RSD为1.26%(n=6)，表明仪器的精密度良好；重复性试验峰面积RSD为1.48%(n=6)，表明该方法的重复性良好；稳定性试验峰面积RSD为1.47%(n=6)，表明天麻苷元供试品溶液在24 h内稳定性良好；回收率试验，平均加样回收率为102.59%(n=6)，RSD为1.96%(n=6)，表明该方法回收率良好。
注：A为空白脂质体溶液，B为对照品溶液，C为供试品溶液，1为天麻苷元。图1 对照品及供试品的HPLC色谱结果Fig.1 HPLC chromatogram of reference substance and sample
2.2 天麻苷元脂质体的制备
天麻苷元与大豆磷脂质量比例的考察结果显示，质量比例为1 ∶2时，EE最小，平均粒径及粒径范围最大；质量比例为1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5的EE和平均粒径差异不大；质量比例为1 ∶3时，PDI及粒径范围较小，因此选择药物与大豆磷脂质量比例为1 ∶3进行后续考察。大豆磷脂与胆固醇比例考察结果表明，大豆磷脂与胆固醇质量比例为5 ∶1时，EE最小，PDI及粒径范围最大；质量比例为3 ∶1或4 ∶1时EE和平均粒径差异不大；但是当质量比例为3 ∶1时，PDI及粒径范围较小，因此选择大豆磷脂与胆固醇质量比例为3 ∶1进行后续实验考察。旋蒸温度的考察结果显示：温度为50 ℃时，EE最小；温度为40、60 ℃的EE差异不大；但当温度为40 ℃时，平均粒径和粒径范围较小，因此选择旋蒸温度为40 ℃进行实验后续考察。水合温度的考察结果显示：温度40、50、60 ℃的EE差异不大；40 ℃时，平均粒径、PDI和粒径范围均较小；因此，选择水合温度为40 ℃进行后续实验考察。水合时间的考察结果表明，水合时间为15 min时，EE最小，平均粒径及粒径范围最大；时间为30、60 min的平均粒径及粒径范围差异不大，由于水合时间为30 min时EE最大，PDI较小，因此选择水合时间为30 min进行后续实验考察。过0.1 μm滤膜次数的考察结果显示，次数为3、5、7次的平均粒径、PDI及粒径范围差异不大；鉴于次数为7次EE最大，因此选择过0.1 μm滤膜次数为7次。
2.3 天麻苷元脂质体理化性质的初步研究
2.3.1脂质体的外观 按最优处方制备的天麻苷元脂质体，外观呈微带淡蓝色的乳白色混悬液，见图2。
图2 天麻苷元脂质体的外观Fig.2 Appearance of Gastrodigenin liposomes
2.3.2脂质体的包封率 根据测得的峰面积，计算得最优处方工艺制备的天麻苷元脂质体EE为21%。
2.3.3脂质体的粒径、粒径范围和PDI 采用马尔文激光粒度测定仪，测得最优处方工艺制备的天麻苷元脂质体的平均粒径为150.39 nm；粒径范围为31.84～688.63 nm；PDI为0.129。天麻苷元脂质体粒度分布较窄，见图3。
图3 天麻苷元脂质体的粒径分布图Fig.3 Particle size distribution of Gastrodigenin liposome
3 讨论
本研究采用乙醇作为绿色溶剂，经典的薄膜分散法制备天麻苷元脂质体，方法简单易操作[19-21]，也可应用于工业化大生产。在天麻苷元脂质体的处方中，胆固醇起到了膜流动性调节剂的作用，大豆磷脂与胆固醇比例的改变对成膜效果有着重要的影响；减压回收溶剂成膜后，加入水化溶液，在一定的温度下形成脂质体的效果较理想[22-24]。
本文研究考察了天麻苷元与大豆磷脂质量比、大豆磷脂与胆固醇质量比、旋蒸温度、水合温度、水合时间以及过滤膜次数，从而确定了最优处方制备工艺。脂质体粒径范围为31.84～688.63 nm，分布较窄且在水中分散较好，有效改善了天麻苷元的水溶性。
目前，脂质体制备用到的水化介质多为水或磷酸盐缓冲液(具体选择何种水化介质需根据药物性质确定)，因此制备得到的大多数载药脂质体均处于水系环境中，存在脂质体融合、药物渗漏以及磷脂水解等问题，不适合长时间贮存[25]，下一步计划将天麻苷元脂质体混悬液进一步制备为天麻苷元脂质体冻干制剂，以提高制剂的稳定性[26]。