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三宝护童羹对变应性鼻炎幼鼠模型细胞免疫机制的影响研究
《云南中医中药》杂志 2024年1期 作者团队：阳成琳 陈利 冯乔芳 冉志玲
摘要：目的 通過免疫因子及蛋白表达水平变化探讨三宝护童羹制剂（SBHTG）对卵蛋白（OVA）致SD幼鼠过敏性鼻炎（AR）肺脾气虚型模型的治疗作用及机制研究。方法 将 32 只2-3周龄SPF级 SD 大鼠分为A组：空白组，B组：模型组，C组：西药组，D组：中药组，每组各8只。适应性喂养5d后，除A组给予生理盐水模拟造模外，其余各组给予全身致敏+局部致敏法共计21d，自第15d起开始给药物干预，14d后处理。通过HE染色法评价鼻黏膜的病理形态学，以ELISA检测鼻炎相关细胞因子水平变化，取脾脏运用Western blot法检测炎症相关蛋白水平变化。结果 与A组比较，B组幼鼠鼻部症状评分、血清IL-4及IgE含量显著升高（P<0.01），三宝护童羹制剂及氯雷他定干预后显著回调；血清中INF-γ含量及脾脏中Foxp3蛋白表达显著降低（P<0.01），三宝护童羹制剂及氯雷他定干预后显著上升。C、D组幼鼠鼻部症状评分、血清Ig E及IL-4水平下降明显（P<0.01）；C、D组幼鼠血清INF-γ含量显著降低（P<0.01）；C、D组脾脏组织中Foxp3蛋白表达显著升高（P<0.01）；C、D组鼻黏膜上皮纤毛较模型组整齐连续，上皮水肿情况、杯状细胞及EOS浸润较B组减轻。结论 推断三宝护童羹可有效调控变应性鼻炎模型幼鼠免疫功能，这可能与上调INF-γ水平及Foxp3蛋白表达水平，下调IL-4、IgE水平有关。
关键词：变应性鼻炎；三宝护童羹；Foxp3蛋白；γ干扰素；白细胞介素 4；免疫球蛋白E
中图分类号：R765.21
文献标志码：A
文章编号：1007-2349（2024）01-0085-08
Effect of Sanbao Hutong Decoction on Cellular Immune Mechanism
of Allergic Rhinitis In Young Rat Model
YANG Cheng-lin，CHEN Li，FENG Qiao-fang，RAN Zhi-ling
（1. Southwest Medical University，Luzhou 646000，Sichuan，China; 2. Changning Hospital of Traditional Chinese Medicine，
Changning 644300，China;3. The Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine，Southwest Medical University，Luzhou 646000，China）
【Abstract】Objective： To study the therapeutic effect and mechanism of Sanbao Hutong Decoction （SBHTG） on allergic rhinitis （AR） model of qi deficiency of lung and spleen in SD young mice induced by OVA through the changes of immune factors and protein expression levels. Methods： 32 SPF SD rats aged 2-3 weeks were divided into blank group A，model group B，western medicine group C and Chinese medicine group D，8 rats each group. After 5 days of adaptive feeding，except for group A，the other groups were given systemic sensitization+local sensitization method for 21 days，drug intervention began on the 15th day，and the treatment was given 14 days later. The pathological morphology of nasal mucosa was evaluated by HE staining，the changes of rhinitis related cytokines were detected by ELISA，and the changes of inflammatory related proteins were detected by Western blot. Results： Compared with those of group A，the nasal symptom score，serum IL-4 and IgE contents were significantly increased in group B （P<0.01），and significantly decreased after intervention with Sanbao Hutong Decoction and loratadine. INF-γ content in serum and Foxp3 protein expression in spleen were significantly decreased （P<0.01），and were significantly increased after intervention with Sanbao Hutong Decoction and loratadine. Nasal symptom scores，serum IgE and IL-4 levels of the rats in groups C and D were significantly decreased （P<0.01）. Serum INF-γ content in groups C and D was significantly decreased （P<0.01）. The expression of Foxp3 protein in spleen tissues of groups C and D was significantly increased （P<0.01）. The nasal mucosal cilia in groups C and D were more orderly and continuous than those in the model group，and the epithelial edema，goblet cells and EOS infiltration were less severe than those in group B. Conclusion： It is concluded that Sanbao Hutong Decoction can effectively regulate the immune function of young mice with allergic rhinitis model，which may be related to up-regulating INF-γ level and Foxp3 protein expression level，and down-regulating IL-4 and IgE level.
【Key words】Allergic Rhinitis; Sanbao Hutong Decoction; Foxp3 Protein; γ Interferon; Interleukin 4; Immunoglobulin E
兒童变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）以鼻痒、流涕、喷嚏为主要症状，常在接触变应原后发作，具有高发病率及高复发率的特点。儿童AR是由免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介导免疫细胞释放化学介质诱发的Ⅰ型变态反应炎性疾病。随着分子免疫学的发展，现已证实AR发病机制与Th1/Th2免疫失衡及Treg细胞分化下调密切相关。目前世界范围内AR患者已超过5亿，我国华中地区儿童患病率最高（17.20%），华东地区患病率最低为（13.94%）。目前临床治疗儿童AR多用鼻内激素及组胺药物，虽起效快速但无法降低复发概率。相关文献表明儿童AR降低了患儿的生活质量，亦可诱发一系列变态反应性疾病，因此尽快探寻长效、经济、温和的儿童AR的治疗方法至关重要。
有研究表明，较于西药来说，中药治疗儿童AR毒副作用更小、远期疗效稳定。临床小儿鼻鼽以脾肺两虚证最为常见，导师在参苓白术散基础上进行加减化裁，得出治疗小儿鼻鼽临床疗效显著、具备良好的社会效益的三宝护童羹（SBHTG），其具有培土生金、肺脾同治之效。因此致力于开展关于调控Th1/Th2细胞失衡及上调Treg细胞分化的免疫学研究，从中医药入手，积极寻找治疗儿童AR的药物关键靶点，为三宝护童羹有效治疗儿童AR提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 SPF级SD雌性大鼠的2～3周幼鼠（50 g±5）g，32只，购于西南医科大学动物实验中心，动物许可编号：SYXK（川）2018-065；饲养于西南医科大学动物房，饲养环境：温度20℃～26℃，湿度40%～70%，饲养期间正常进食、饮水。
1.2 实验药品
1.2.1 中药 三宝护童羹（山药10 g，黄精10 g，茯苓10 g，白扁豆10 g，薏苡仁10 g，陈皮6 g，莲子6 g，大枣6 g）免煎颗粒剂型购于西南医科大学附属中医医院中药房。将三宝护童羹制备为生药量浓度10.12 g/mL。
1.2.2 西药 氯雷他定片，购自西南医科大学附属中医院第一西药房，5mg/袋，海南普利制药股份有限公司（批号：H20110018）。使用蒸馏水溶解后稀释为浓度 0.1mg/mL。
1.3 实验试剂 见表1。
1.4 实验仪器 见表2。
1.5 方法
1.5.1 幼鼠AR造模 采用“全身致敏+局部致敏法”建立变应性鼻炎模型后将卵白蛋白（OAV）30 mg、AL（OH）3 3 g和100 mL 0.9%生理盐水混合后注释计量为0.01 mL·g，腹腔注射初次免疫，第15 d双侧鼻孔给予 4%OVA 200μg（50 μL）滴鼻加强免疫。
1.5.2 肺脾气虚造模 肺气虚模型：参考《实用中医证候动物模型学》，购置80cm×40cm×40cm PVC材料收纳盒，一双孔艾灸盒，每次点燃2根香烟固定在艾灸盒内，将艾灸盒放置于收纳盒中，进行烟熏，每次烟熏30 min，每次8只，共14 d。脾气虚模型：参考《实用中医证候动物模型学》，给予大黄苦寒泄下法建立，西南医科大学附属中医医院制剂室熬制浓度15%大黄液，以0.1 mL/10 g进行灌胃，每天1次，共7 d。
1.5.3 分组及给药 选取32只雌性幼鼠随机成4组，每组8只，分别为A组：空白组，B组：模型组，C组：西药组，D组：中药组。C组予地氯雷他定干混悬剂0.525 g·kg，D组予三宝护童羹制剂7.14 g·kg。A组与B组同期给予等量生理盐水。
1.5.4 检测步骤
1.5.4.1 行为学观察 AR造模评价：鼻部症状激发后观察10min，采用叠加量化积分法见表3，总分≥5分则为造模成功。
1.5.4.2 肺脾气虚造模评价 观察幼鼠出现便溏、脱肛、饮食减少、体重增加较空白组减慢、倦卧、萎靡等脾气虚及行动迟缓、蜷伏不动等气虚症状则视为成功。
1.5.4.3 标本采集及处理 在末次灌胃给药24 h后取材。将大鼠麻醉成功后采集腹主动脉血液约5 mL，静置2 h，3500 r/min离心15 min后-80℃冰箱保存。剥离大鼠脾脏，装入冻存管中置于-80℃冰箱保存。
取大鼠鼻黏膜，4%多聚甲醛固定，脱水石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色后观察。
1.5.4.4 鼻组织形态学测定 取大鼠鼻黏膜进行HE染色，显微镜下观察鼻黏膜组织病理学改变。
1.5.4.5 细胞免疫因子测定 参照 ELISA试剂盒说明书，按步骤检测大鼠血清IL-4、INF-γ、IgE水平。
1.6 Western blot法检测大鼠脾脏Foxp3蛋白表达水平 取大鼠脾脏组织，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳，转膜后脱脂奶粉封闭1h，加入一抗Foxp3（1∶1000），4℃孵育过夜，二抗室温孵育1h，TBST洗膜，二抗室温孵育1h，TBST洗膜，加入ECL发光显色液，放入暗室，置入凝胶成像系统（bio-rad）成像拍照，用凝胶成像系统分析蛋白及内参β-actin表达条带的灰度值。
1.7 统计学方法 运用SPSS27.0统计学软件进行统计学分析，本实验数据为计量资料，样本量<50，故选择夏皮洛-威尔克（Shapiro-wilk，S-W）进行正态性检验，符合正态分布以（x±s）表示，若方差齐则2组数据采用独立样本t检验，多组数据采用单因素方差分析；若方差不齐，采用t＇检验；不服从正态分布者，采用非参数Kruskal-wallis检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠鼻部症状评分结果 A组、B组、C组、D组鼻部症状评分分别为（0.4±0.5）分、（6.9±0.6）分、（3.0±0.8）分、（3.1±0.8）分，B组、C组、D组评分差异显著（P<0.001），C组及D组之间评分差异无统计学意义（P>0.05），可以说明D组及C组均可明显减轻鼻部症状，见表 4、图 1。C组及D组与B组之间评分差异显著（P<0.001），C组及D组之间评分差异无统计学意义（P>0.05），可以说明D组及C组均可明显减轻鼻部症状。
2.2 HE染色形态学观察 变应性鼻炎的炎症损伤主要表现为鼻黏膜局部的组织重塑。本实验结果显示，变应性鼻炎动物模型组鼻黏膜上皮结构紊乱且不完整，纤毛粗细不一，出现上皮细胞固缩、坏死甚至脱落现象，可见明显腺体增生、肿胀、出血及嗜酸性粒细胞等炎性细胞浸润，显示出鼻黏膜组织重塑特征；空白组大鼠鼻黏膜组织结构完整、平滑且排列整齐，腺体大小正常，未见明显炎性细胞浸润、上皮坏死脱落及明显血管扩张或充血现象；与模型组相比，中药、西药组纤毛脱落现象减少，仍有少许腺体增生，血管稍扩张，组织水肿较模型组明显好转，而上皮细胞排列较整齐，其组织重塑现象减轻，见图 2。
2.3 干预后各组IL-4、INF-Y、IgE水平比较 C组与D组IgE水平较B组水平显著降低（P<0.05）；D组较C组IgE水平差异无统计学意义（P>0.05）。说明地氯雷他定可有效降低IgE水平；地氯雷他定较三宝护童羹降低IgE水平效果明显。见图 3。与A组相比，B组血清中INF-γ含量显著降低（P<0.05），IL-4含量显著升高（P<0.05）；与B组相比，C、D组血清中INF-γ含量显著升高（P<0.05），D组与C组IFN-γ水平差异无统计学意义（P<0.05）；与B组相比，C、D组血清中IL-4含量降低（P<0.05），且D组变化显著于C组（P<0.05），两者差异显著（P<0.001）；说明地氯雷他定及三宝护童羹均可有效降低IL-4水平、提高IFN-γ水平，三宝护童羹降低IL-4水平明显于地氯雷他定，地氯雷他定提高IFN-γ水平明显于三宝护童羹。见表5、图4、图5。
2.5 各组大鼠幼鼠脾脏中Foxp3蛋白表达水平比较
结果由图6、表6所示，Foxp3蛋白表达水平H=25.636，P<0.001，说明四组数据之间存在统计学差异，以中位数（P25，P75）做表。B组Foxp3蛋白表达水平较空白组明显下降（P<0.001），C组及D组Foxp3蛋白表达水平均模型组上升（P<0.01），C组与D组之间Foxp3蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.01）。
3 讨论
文献研究表明AR已经成为儿童主要的呼吸道炎性疾病，且常伴发或继发多种并发症或疾病。近年来研究表明，中医在治疗AR方面具有长效、安全、毒副作用小、价格低廉等西医治疗无法兼顾的优势。我们的前期研究已证实，三宝护童羹制剂对于机体的减少呼吸系统疾病发生、肠道免疫及细胞免疫功能都具有正向调节作用。多种炎症及免疫细胞因子参与了在AR的发病过程，当前Th1/Th2免疫失衡及Treg分化是AR发病的研究热点。因此本研究继承了前期研究的基础，运用三宝护童羹治疗AR幼鼠（肺脾气虚型）并观察治疗前后Th1/Th2免疫失衡的下游细胞因子INF-γ、IL-4及Treg细胞的上游转录因子Foxp3蛋白水平的变化情况，进一步明确了三宝护童羹治疗儿童AR与纠正Th1/Th2免疫失衡及上调Treg细胞分化有关，为三宝护童羹治疗儿童 AR 提供免疫学相关依据。
儿童变应性鼻炎在中医属于“鼻鼽”范畴，是内外因共同作用的结果，外因责之于外感邪气，内因责于小儿肺、脾、肾不足的生理特点密切相关。导师冉志玲教授依据“百病皆由脾胃生”的观点提出本病由肺脾肾三脏所致，其中以脾虚为核心。小儿脏腑娇弱、脾本不足，加之生长发育旺盛、脾胃负担繁重，每当饮食、用药稍有不慎，脾胃受损，百病遂生；小儿肺本不足，脾肺为母子之脏，脾气不足导致肺气更虚、抗邪能力进一步减弱；肾为先天之本，决定先天禀赋，禀赋不足则体质虚弱不耐邪侵。凡表虚不能卫外者，当先建立中气，以脾旺荫护五脏，表自固而邪不干。导师冉志玲教授总结多年临证经验：小儿鼻鼽由肺脾气虚为主，故治疗上以培土生金，健脾益肺为主，使脾胃健而邪自去，同时正气存内，可减少复发；以“健脾益气，补肺益肾”为法自拟药膳方三宝护童羹治疗过敏性鼻炎患儿，并在临床上取得满意疗效，且因其药食同源，味道甘美，简便价廉，为广大患儿及家属广泛接受。
三宝护童羹组成为山药10 g，黄精10 g，茯苓10 g，白扁豆10 g，薏苡仁10 g，陈皮6 g，莲子6 g，大枣6 g。据研究显示，山药的主要成分为山药多糖，山药蛋白及皂苷类：其中山药多糖可有效减少炎症因子分泌，阻断炎症信号通路以抗炎；还能促进脾淋巴细胞增殖及分化从而强化T淋巴细胞的增殖，提高优势细胞因子分泌水平，最终能使机体免疫力增强。黄精中多糖及皂苷是起作用的主要成分，其中黄精多糖可正向调节B淋巴细胞的免疫球蛋白分泌能力。茯苓中有效成分：茯苓多糖能增加血清中免疫球蛋白水平，从而增强免疫；茯苓多糖和茯苓三萜亦可通过抑制伤处肉芽肿的形成而起到抗炎作用。薏苡仁多糖能促进NK细胞活性及增殖功能，增强免疫、降低血管通透性及炎症因子分泌水平起到抗炎作用。有研究指出了陈皮“走窜”之性，故其能起到运脾之效，其主要成分为陈皮苷，其中陈皮挥发油可解痉平喘，抗组胺。莲子多酚具有抗氧化、抑制沙门氏菌及大肠杆菌的作用。体外实验表明大枣多糖能抑制促炎因子的释放、增强体液免疫和細胞免疫。
IgE即是免疫球蛋白E，是免疫球蛋白类型中的一种主要，其介导Ⅰ型变态反应的发生，与变态反应、寄生虫感染及皮肤过敏等有关。IgE在AR发病机制：变应原进入机体后，被抗原呈递细胞吞并激活B淋巴细胞，导致变应原特异性IgE的产生，IgE附着于肥大细胞和嗜酸性粒细胞表面，当再次接触变应原后，IgE与受体结合交联，激活肥大细胞、EOS释放组胺和白三烯等炎症递质，进而刺激鼻黏膜引发鼻痒、喷嚏、流涕等症状。本文实验表明，与模型组比较，西药、中药组血清中IgE含量显著降低，且中药组比西药组IgE含量降低变化显著，表明三宝护童羹能够通过减少变应原特异性IgE的产生，抑制了IgE介导的免疫反应，从而有效阻止AR发生。
IL-4主要是由CD4T或活化的肥大细胞产生，其能促进T、B细胞增殖和诱导黏附分子表达。IL-4能增强B细胞对细胞的抗原递呈作用，抑制嗜酸粒细胞凋亡，促进体液免疫应答，特别是促进IgE介导的免疫反应。研究表明，IL-4为Ig E的正性调节因子，IL-4的过度分泌，可导致AR患者血清中IgE合成过多。有实验证明IL-4、Ig E均参与AR的免疫发病机制，所以降低IL-4含量，可减少IgE合成，成为了防治AR的重要途径之一。INF-γ又称免疫干扰素或Ⅱ型干扰素，是抗原或有丝分裂原等刺激T细胞而产生的具有免疫调节、抗病毒及抗肿瘤活性的糖蛋白，它能广泛地使各种类型的细胞表达，放大免疫应答的识别阶段，促进T和B淋巴细胞分化，促进细胞毒性T细胞成熟并刺激B细胞分泌抗体，激活中性粒细胞，除此之外它还是单核吞噬细胞、NK细胞、血管内皮细胞的激活因子及IgE的拮抗因子。它可以阻止IL-4过度分泌而介入的IgE的生成，从而压制机体内IgE的产生，减少AR发生概率或缓解AR症状。INF-γ和IL-4分别是Th1和Th2细胞分泌的标志因子，在正常机体中，INF-γ主要由Th1细胞产生，调节细胞免疫；IL-4主要由Th2细胞产生，调节体液免疫。Th2型细胞的一个重要作用机制是生成IgE和形成以IgE为基础的嗜酸性粒细胞（eosinophil，EOS）与肥大细胞介导的免疫反应，如：变应性鼻炎，Th2细胞因子在AR的免疫病因学中起着重要的作用。Th1/Th2细胞因子分泌失调也是多种免疫炎症疾病的发病基础，如反复上呼吸道感染。前期孙涟玮研究表明研究表明三宝护童羹可有效的提高反复呼吸道感染患儿的免疫力，降低呼吸道感染的发生率；吕茂林研究表明三宝护童羹可捅过调节肠道菌群及免疫功能防治反复呼吸道感染。同样刘慧霞研究表明患儿免疫力的提升与变应性鼻炎治疗呈正相关。本文实验表明，与模型组比较，西药、中药组血清中INF-γ含量显著升高，IL-4及IgE含量显著降低，且中药组比西药组IL-4含量降低变化显著，这说明三宝护童羹能够逆转变应性鼻炎幼鼠血清中Th2细胞因子相对Th1细胞因子的免疫反应优势，使二者趋于正常。表明三宝护童羹能够通过抑制Th2细胞因子，上调Th1细胞因子表达，从而纠正Th1/Th2免疫失衡，有效的增加抗炎细胞因子分泌、抑制炎性介质，抑制了过度免疫反应，最终一定程度上阻断AR发病途径、减轻AR发病症状、降低AR发病概率。
Foxp3是Treg細胞的特征性转录因子，是Treg细胞发育和功能维持的关键性调节基因，对其生长发育和健康的生理功能有着决定性的作用。而Treg细胞作为T细胞亚群的一种承担了维持机体免疫稳态和限制过度免疫反应的重任，Foxp3的过表达最终可促进机体免疫耐受。就AR来说Foxp3是Treg上游的特异性转录因子，可促进Treg分化和成熟，发挥炎症和免疫负向调控作用，维持免疫稳态。有研究证实Foxp3的数量减少和功能减弱都可以刺激AR的发病。近期的动物实验证实，采用蛆提取物干预 AR模型小鼠后，Foxp3的表达增加，发现Treg分化也随之增加，结果提示小鼠AR相关症状明显缓解，并由此推断Foxp3表达增加促进Treg分化，从而抑制AR过度的炎症反应。Zhu X等有关哮喘的研究提示存在Treg和Foxp3 mRNA表达在哮喘机体中比例降低的现象，因此该团队提出哮喘的发病概率和严重程度与Foxp3、Treg成负相关。有研究发现Foxp3蛋白表达下调竟样出现在AR发病过程中，因此从发病机制角度来说，AR与支气管哮喘相似度极高。由此推断，AR炎症反应的加剧，可能与Foxp3表达下调而导致Treg的分化减少呈正相关。本文经动物实验研究发现，与模型组比较，西药、中药组脾脏组织中Foxp3蛋白表达显著升高，且西药组与中药组无差别，这说明三宝护童羹和氯雷他定均可有效上调AR幼鼠脾脏中Foxp3蛋白表达。因此，综合文献报道和我们的实验结果，我们合理推测AR幼鼠在经三宝护童羹治疗后上调Foxp3蛋白表达，使得Treg细胞表达增强，最终下调Th2细胞因子从而抑制了AR的发生；变应性鼻炎幼鼠经三宝护童羹治疗后Foxp3蛋白表达显著上升，提示三宝护童羹对Treg细胞具有直接或者间接的调节作用，其具体机制有待于进一步研究。
综上所述，三宝护童羹可有效减轻变应性鼻炎幼鼠症状，其机制可能与调控Th1/Th2细胞免疫失衡和上调Treg细胞表达有关。
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（收稿日期：2023-08-21）