陈月娟+刘文简+陈丹娜+詹贤福+蒋林

[摘要] 应用Cytb序列对燕窝进行DNA条形码（DNA barcodes）研究，为燕窝的溯源研究及全面评价燕窝质量提供理论依据。以马来西亚、印度尼西亚、越南、泰国等地的燕窝，共计39个样本为研究对象，提取基因组DNA，扩增Cytb序列并双向测序。采用MEGA 7.0软件，对39条样本序列及36条从Gen Bank中下载5种金丝燕的Cytb序列进行序列特征分析，基于Kimura双参数法计算序列种内、种间遗传距离，构建NJ和UPGMA系统聚类树进行分析。研究结果表明，39个样本共来源于3个不同的金丝燕物种。Cytb序列种间变异显著大于其种内变异，可以准确地区分不同种类的燕窝。所构建的NJ和UPGMA系统发育树，也能将全部物种区分开。表明基于Cytb序列的DNA条形码技术可用于准确快速地鉴别燕窝的生物基原。

[关键词] 燕窝； DNA条形码； Cytb序列； 物种鉴定

[Abstract] To provide theoretical basis for the traceability and quality evaluation of edible bird′s nests （EBNs）， the Cytb sequence was applied to identify the origin of EBNs. A total of 39 experiment samples were collected from Malaysia， Indonesia， Vietnam and Thailand. Genomic DNA was extracted for the PCR reaction. The amplified products were sequenced. 36 sequences were downloaded from Gen Bank including edible nest swiftlet， black nest swiftlet， mascarene swiftlet， pacific swiftlet and germain′s swiftlet. MEGA 7.0 was used to analyze the distinction of sequences by the method of calculating the distances in intraspecific and interspecific divergences and constructing NJ and UPMGA phylogenetic tree based on Kimera-2-parameter model. The results showed that 39 samples were from three kinds of EBNs. Interspecific divergences were significantly greater than the intraspecific one. Samples could be successfully distinguished by NJ and UPMGA phylogenetic tree. In conclusion， Cytb sequence could be used to distinguish the origin of EBNs and it is efficient for tracing the origin species of EBNs.

[Key words] edible bird′s nests； DNA barcodes； Cytb； species identification

燕窝为雨燕科Apodidae金丝燕属Aerodramus和侏金丝燕属Collocalia的几种燕类分泌的唾液与其绒羽混合筑成的巢窝，按筑巢的地方可分为“屋燕”和“洞燕”，主要产于印度尼西亚、马来西亚等东南亚国家[1-2]。燕窝，性平、味甘，归心、肺、肾三经，是一种宜药宜膳的高级保健品[3-4]，具有丰富的营养价值和药用价值。中医认为燕窝具有养阴润燥、益气补中、化痰止咳之功效[5]。古代医书《本草求真》中记载[6]：“燕窝入肺生气，入肾滋水，入胃补中，俾其补不致燥，润不致滞，而为药中至平至美之味者也”。燕窝中含有大量蛋白质及生物活性物质[7]，近年来研究表明，燕窝具有抗衰老、提高免疫力、抗病毒、强骨作用等功效[8-10]。

燕窝价格昂贵，市场需求量巨大，利益丰厚。它的价格和品质不仅受燕窝颜色、成分、形状等影响，而且不同种属金丝燕所产的燕窝种类不同，在价格和质量上也差异巨大[11]。传统意义上认为燕窝的质量与产地有密切的关系，如越南会安的燕窝优于印尼、泰国等地的燕窝，这可能与不同产地金丝燕物种不同有关[4]。鸟类分类学家将产燕窝的金丝燕分为两大类：一是雨燕科侏金丝燕属Collocalia，包括白腹金丝燕C.esculenta、穴金丝燕C.linchi；二是雨燕科金丝燕属Aerodramus，包括爪哇金丝燕A. fuciphagus、戈式金丝燕A.germani、大金丝燕A.maximus、印度金丝燕A.sunicolor、小灰腰金丝燕A.francicus[12]。目前国内外对燕窝生物基原方面的研究报道较少，市场上以劣充优的现象时有发生。本研究利用DNA条形码鉴定技术，对39个未知来源的毛燕窝进行鉴定，为燕窝的溯源研究及全面评价燕窝质量提供参考。

1 材料

ESP-600型电泳仪，C1000TM PCR仪，GBOX-F3凝胶成像仪，Centrifuge 5417R台式高速冷冻离心机，Nanodrop2000微量定量仪口腔拭子基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]，引物（上海捷瑞生物工程有限公司广州分公司），2×Taq PCR StarMix with Loading Dye、琼脂糖、50×TAE（北京康润诚业生物科技有限公司），Gold View I型核酸染色劑，DNA Marker（上海捷瑞生物工程有限公司），其余试剂均为分析纯。endprint

本研究所有样品均经中山大学药学院蒋林研究员鉴定，凭证样本保存于中山大学药学院。实验样本信息见表1，从Genbank下载36条Cytb序列，Gen Bank登录号等信息见表2。

2 方法

2.1 总DNA提取 将燕窝样品于50 ℃烘48 h，研磨成细粉，过120目筛，密封保存于-20 ℃冰箱备用。采用口腔拭子基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。称取燕窝样品约40 mg，按照试剂盒操作说明进行总DNA的提取，利用微量定量仪对提取DNA的浓度和纯度进行检测。

2.2 PCR扩增及扩增产物的检测 扩增序列的引物为Genbank中上传最多的Cytb基因序列[13-14]，见表3。PCR反应体系为20 μL：其中DNA模板1 μL，正向引物（10 μmol·L-1） 1 μL，反向引物（10 μmol·L-1） 1 μL，2×Taq PCR StarMix 10 μL， ddH2O 7 μL。PCR反应条件的设置：94 ℃，2 min；94 ℃，30 s；55～65 ℃，30 s；72 ℃，1 min，35个循环；72 ℃，5 min。取5 μL的PCR 产物，用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳。Marker采用上海捷瑞DL 2501，Marker相对分子质量标准从上至下为2 000，1 000，750，500，250，100 bp。将检测合格的PCR扩增产物送至生工生物工程有限公司进行双向测序。

2.3 数据处理 测序结果用DNASTAR软件包中的Seqman和Editseq进行校对拼接，去除引物区和低质量的序列，然后通过Clustal X V2.1[15]校对，MEGA 7.0[16]对齐删减，最终选取所有样品长度均为530 bp的一段Cytb序列。从Genbank下载的36条Cytb序列，与拼接好的样品序列比对后，对齐删减获得相对应的区段。所有序列应用MEGA 7.0软件比对并计算K2P（Kimura-2-parameter）遗传距离[17]，建立NJ系统聚类树[18]和UPGMA系统聚类树[19]。在Gen Bank上通过BLAST相似性搜索法[20]，进行序列的比对分析，验证各样品的生物基原。

3 结果与分析

3.1 样品序列特征分析 利用MEGA 7.0软件，将以Cytb为引物所获得的39条序列进行比对，最终选取对齐后的530 bp的序列进行分析。所有序列不含插入或缺失碱基以及终止密码子。结果显示，序列中保守位点516个，变异位点14个，简约信息位点7个，单一多态位点7个。A，T，C，G碱基平均量分别为27.3%，23.2%，35.1%，14.4%。

3.2 种内种间遗传距离分析 在软件MEGA 7.0中应用Kimura双参数法计算39条样品序列和36条从Genbank下载的5种金丝燕的Cytb序列的种内遗传距离和种间遗传距离。结果显示，大金丝燕和小灰腰金丝燕与其他金丝燕种间遗传距离在1.85～1.92，其他3种金丝燕种间遗传变异在0.02～0.08，种内遗传距离在0.000 3～0.023 6，见表4。种间遗传距离明显高于种内遗传距离，表明各序列的种间变异均显著大于种内变异，这与条形码种间变异大而种内变异小的要求是相一致的[18]，说明Cytb条形码序列适用于燕窝生物基原的鉴定，并且可以对其进行有效的区分。

3.3 NJ系统聚类树和UPGMA系统聚类树 基于Cytb序列构建的NJ系统聚类树和UPGMA系统聚类树见图1，2，结果显示2种方法获得的物种聚集信息分布基本一致。所有序列被聚为两大支，各个序列的建树效果良好，基本上能将不同种类燕窝区分开。

UPGMA系统聚类树节点的支持率明显高于NJ系统聚类树，以UPGMA系统聚类树进行分析。爪哇金丝燕、白腰雨燕和戈氏金丝燕聚为一大支，节点支持率为99%。白腰雨燕单独聚为一小支，爪哇金丝燕和戈氏金丝燕聚为一小支，同时又各自聚为不同的小支。大金丝燕和小灰腰金丝燕聚为一大支，节点支持率均为99%，大金丝燕和小灰腰金丝燕又各自聚为一小支。06号样品与小灰腰金丝燕聚为一大支，节点支持率为89%，表明样品生物基原为小灰腰金丝燕。39号样品与戈式金丝燕聚为一支，节点支持率为56%，其生物基原为戈式金丝燕。其余样品均与爪哇金丝燕聚为一支，表明其生物基原为爪哇金丝燕。以上结果与Blast搜索结果一致，表明Cytb序列可对不同种类的燕窝生物基原进行准确鉴别。

4 讨论

DNA条形码是近年来生物分类和鉴定的研究热点和方向，是利用基因组中一段公认的标准短序列来进行物种鉴定的分子诊断新技术[21]。DNA条形码研究的主要目的是用于物种的鉴定和新种的发现[22-23]，特别是在鉴定未知来源样品方面有着极大 的优势[24]。近年来在经过加工的肉类、海鲜食品的物种溯源方面得到成功的应用[25-26]，为食品质量监督提供保障。燕窝从采摘到加工成品，需要经过复杂的挑毛、塑型等过程，成品的外形十分相似，无法通过形态特征等进行物种溯源鉴定。本文采用DNA条形码技术，对39份燕窝样品进行溯源研究。实验设计Cytb序列作为扩增引物，扩增和测序成功的效率高达100%。对样本Cytb序列进行BLAST比对，结果显示其相似度为99%～100%，E值为0，为鉴定的准确性提供保障。

《中国药典》2010年版[27]和2015年版[28]已正式收载了DNA分子鉴别方法及中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则。DNA条形码技术可以为动植物来源的中药材提供快速、准确的鉴定[29]。它通过构建NJ，UPGMA系统聚类树、计算遗传距离、分析变异位点等方法相结合准确鉴定出中药材基原。本研究基于Cytb序列将DNA条形码技术应用于燕窝样品生物基原的鉴定。结果表明：Cytb序列种间变异显著大于其种内变异，符合理想的DNA条形码 基因片段的特点[30]。所构建的NJ和UPGMA系统发育树结果显示所有序列被聚为两大支，各个序列的建树效果良好，且2种方法获得的物种聚集信息分布基本一致，可以将全部物种区分开。DNA条形码技术对燕窝样品的鉴定成功為燕窝的溯源研究及全面评价燕窝质量提供理论参考，同时也为合理开发燕窝资源，规范燕窝市场提供理论依据。endprint

[致谢] 感谢钟元、周王晓云、郭襄、林国超、柯海燕、许旭、宝迪、周利和、丁香、陶敏等提供燕窝样品。

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[责任编辑 吕冬梅]endprint