刘方庆 胡梦英 文陇英

(西南山地濒危鸟类保护四川省高等学校重点实验室，乐山师范学院生命科学学院，乐山，614000)

燕科(Hirundinidae)鸟类隶属于雀形目(Passeriformes)，分布在中国的有4属12种，分别为河燕属Pseudochelidon(如白眼河燕P.sirintarae等)，沙燕属Riparia(如崖沙燕R.riparia等)，燕属Hirundo(如家燕Hirundorustica等)和毛脚燕属Delichon(如烟腹毛脚燕D.dasypus等)；雨燕科(Apodidae)鸟类隶属于雨燕目(Apodiformes)，分布在中国的有5属9种，分别为金丝燕属Aerodramus(如短嘴金丝燕Ae.brevirostris等)，针尾燕属Hirundapus(如白喉针尾雨燕Hirundapuscaudacutus等)，棕雨燕属Cypsiurus(如棕雨燕C.balasiensis等)，高山雨燕属Tachymarptis(如高山雨燕T.melba等)以及雨燕属Apus(如白腰雨燕Ap.pacificus等)。

传统的宏观分类学认为燕科和雨燕科分别隶属于雀形目和雨燕目，其分类依据是两者之间的形态特征和羽色特点等；有关鸟类分类及进化的结果多是从形态结构生理特征等方面获得的，由于学者们对许多动物表型特征观点的不一致，许多问题并没有形成统一的结果而未能得到解决[1-2]，例如，淡腰金丝燕(Aerodramusgermani)属雨燕目雨燕科金丝燕属，又名戈氏金丝燕，是纤小(12 cm)的深色金丝燕，尾略呈叉形，上体黑褐，腰灰白、色淡，而尾部色深，下体灰褐，腹部具浅色横斑；国内几乎没有淡腰金丝燕的影像资料，有些学者把此种归入爪哇金丝燕下的亚种Aerodramusfuciphagagermani[3-4]。但是另外一些学者将金丝燕属(如淡腰金丝燕(又名戈氏金丝燕))归为Collocaliagermani[5]。

随着分子生物学技术的迅速发展，分子进化已成为近年来进化生物学研究中的一个重要方面，而分子生物学手段的应用可以为解决这一问题提供很重要的佐证[6]。

线粒体DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)是动物细胞核外DNA，具有分子结构简单，母系遗传，进化速率快，缺少重组等特点，已经成为群体遗传结构、地理变异、系统发育等研究领域的有效分子标记[7-9]。常用来作为系统发育和系统地理研究标记的基因有Cytb，COI(线粒体细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ)，12S rRNA，16S rRNA以及ND2、 ND3等基因。其中细胞色素b(Cytochromeb，Cytb)基因的结构和功能在mtDNA 的13个蛋白质编码基因中被了解的最为清楚，且进化速度适中，因此是鸟类分子系统发育中常用的遗传标记之一[10]。已有的研究结果显示，Cytb基因的种间分歧度为1%～10%，这一分歧度既能区别物种，又可忽略多重替换[11]。近年来利用线粒体基因对不同物种的系统发育研究已经越来越成熟和普遍。

目前国内对燕科鸟类多集中在繁殖生态和繁殖习性等方面[12-14]。对雨燕科鸟类尤其是金丝燕属鸟类的研究多集中在燕窝的营养成分品质鉴定以及回声定位机制等方面。如研究者利用Cytb、ND2、COI、12S rRNA等条形码序列，采用实时荧光定量PCR技术对32种不同国家和不同品种的燕窝商品进行了品质鉴别，并探讨不同种类燕窝的品质分类关联，为燕窝的品质鉴定提供更为全面的分子生物学数据。简叶叶[15]等对燕窝的来源、营养成分和主要活性物质、功能作用等问题进行了综述，并总结了燕窝掺伪的鉴别方法：理化鉴定、光谱鉴定、生物鉴定及其他仪器鉴别法[15-16]。此外，一些学者对短嘴金丝燕回声定位机制及其归巢行为进行了研究，初步阐明了此物种回声定位的叫声类型和频率波段范围[17-18]。然而对于燕科和雨燕科系统发育及其亲缘关系的研究在国内几乎未见报道。

本文通过选择物燕科和雨燕科共13个物种，其中雀形目燕科8种，雨燕目雨燕科5种，以线粒体基因Cytb作为分子标记，通过分子生物学手段对燕科和雨燕科部分鸟类进行重建系统发育树，以验证分子生物学分类结果是否与宏观形态学分类结果相一致。

1 研究方法

从NCBI(National Center for Biotechnology Information)网站中下载燕科和雨燕科13个物种线粒体Cytb序列，所获得的物种NCBI序列号见表1。数据处理：用Bioedit[19]软件将所有序列进行多重比对后去掉两端多余部分，裁剪整齐，得到序列长度为999 bp，然后保存为.pir文件，再将此文件导入软件DanSP 5.0[20]中，通过此软件生成.nex单倍型文件。采用贝叶斯推论法(Bayesian Inference)和最大似然法(ML，Maximum Likelihood)以雁形目(Anseriformes)鸭科(Anatidae)雁属(Anser)灰雁(Anseranser)作为外群对燕科和雨燕科13个物种进行系统发育树重建。通过MrModeltest 2.3[21]软件检验得到贝叶斯和最大似然法的最适模型为GTR+I+G。在MrBayes[22]中对Cytb设置 1百万代运行(至sd<0.01)，分析树时均舍弃前2500颗(burnin=2500)。在PAUP 4.10[23]软件中运行ML树，设置重复1000代。得到的树文件(.tre)通过Figtree[24]软件查看并进行系统发育树节点支持率的设置，然后导出图片格式保存。物种两两之间的遗传距离通过MEGA 6[25]中的p遗传距离方法计算。

表1 燕科和雨燕科部分鸟类NCBI序列号

Tab.1 The NCBI sequence number of species for part ofHirundinidae and Apodidae

2 结果

2.1 碱基组成

燕科和雨燕科13种鸟类Cytb片段经过比对裁剪最后得到序列长度为999 bp(表2)。4种碱基含量平均分别为：A(27.707%)、T(24.544%)、C(34.306%)以及G(13.443%)。从碱基组成偏向性来看，A+T 含量(52.251%)略高于G+C 含量(47.749 %)(表2)。

表2 燕科、雨燕科13种鸟类Cyt b碱基含量

Tab.2 The contents of base pair for Hirundinidae and Apodidae

续表2

将比对并裁剪后的序列进行Modeltest检验后得到最大似然法(ML)和贝叶斯推论法(BI)的最适核苷酸替代模型为GTR+I+G。其中4种碱基频率分别为A(0.3157)、T(0.1770)、C(0.4024)以及G(0.1049)。

表3 ML和 BI分析所用核苷酸替代模型及参数

Tab.3 Models and parameters used in ML and BI analysis

注：利用hLRTs和AIC标准选择的最佳模型都是GTR+I+G。其中G表示Gamma分布参数，I表示不变位点比例

Note：The best model of standard is GTR+I+G for hLRT and AIC.The G represents Gamma distribution shape parameter，I represents proportion of invariable sites

2.2 系统发育关系

采用贝叶斯推论法(BI)对燕科和雨燕科13种鸟类重建系统发育树，结果表明，燕科8种鸟类和雨燕科5种鸟类分别形成两大单独的支系，且节点后验概率达到了100%。其中，燕科鸟类分支中金腰燕(Cecropisdaurica)首先分化出来形成单独的一个支系，随后沙燕属、燕属和毛脚燕属聚在一起形成一个大的分支。在雨燕科支系中，短嘴金丝燕最早分化出来形成单独的分支，其余雨燕属的5个种聚在一起形成一个大的支系(图1)。

最大似然法(ML)构建的系统发育树结果与贝叶斯推论法构建的系统发育树具有相同的拓扑结构。燕科8种鸟类和雨燕科5种鸟类分别形成两大单独的支系，其中，燕科鸟类分支中金腰燕首先分化出来形成单独的一个支系，随后沙燕属、燕属和毛脚燕属7种鸟类聚在一起形成一个大的分支。在雨燕科支系中，短嘴金丝燕最早分化出来形成单独的分支，其余雨燕属的5个种聚在一起形成一个大的支系(图2)。

2.3 遗传距离

燕科和雨燕科13个物种两两之间的遗传距离结果表明，白腰雨燕和洋斑燕(Hirundotahitica)之间遗传距离最大，达到0.197，暗背雨燕(Apusacuticauda)和白腰雨燕之间的遗传距离最小，为0.035。燕科内部遗传距离最大的为金腰燕和洋斑燕，两者之间遗传距离达到0.145，遗传距离最小的是黑喉毛脚燕(Delichonnipalensis)和烟腹毛脚燕(D.dasypus)，为0.042。雨燕科内部遗传距离最大的为小白腰雨燕和短嘴金丝燕，其两者之间的遗传距离为0.096，遗传距离最小的为白腰雨燕和暗背雨燕，两者之间的遗传距离为0.035。内群与外群之间遗传距离均较大，其范围在0.169～0.208之间。

图1 燕科和雨燕科部分鸟类系统发育树(BI，Bayesian Inference)Fig.1 The phylogenetic tree of 13 species with Bayesianinference for Hirundinidae and Apodidae

图2 燕科和雨燕科部分鸟类系统发育树(ML，Maximum Likelihood)Fig.2 The phylogenetic tree of 13 species with MaximumLikelihood for Hirundinidae and Apodidae

表4 燕科、雨燕科部分鸟类之间遗传距离

Tab.4 The genetic distance among species for Hirundinidae and Apodidae

3 讨论

燕科和雨燕科13种鸟类Cytb基因分析结果显示，4种碱基含量平均分别为：A(27.707%)、T(24.544%)、C(34.306%)以及G(13.443%)。碱基组成百分比显示出碱基C的含量相对丰富，G的含量相对较低；所有序列嘧啶(C+T)的平均含量达58.850%，嘌呤(A+G)的平均含量为41.150%，嘧啶含量明显高于嘌呤含量，表明碱基组成存在偏向性；且类似的碱基偏倚现象在雀形目鸟类中以及其他鸟类研究中也有发现[26-28]。本文通过对雀形目燕科和雨燕目雨燕科共13种鸟类基于线粒体基因Cytb进行系统发育树的重建，结果表明燕科所有物种聚在一起形成单独的一个分支，雨燕科所有物种聚在一起形成一个单独的分支，其聚类结果与形态学分类相一致。

本文研究结果表明，燕科鸟类和雨燕科鸟类明显分为两个不同的支系，燕科8种鸟类单独聚在一起，雨燕科5种鸟类聚在一起，且最大似然法和贝叶斯推理法所建系统发育树具有相同的拓扑结构。对燕科和雨燕科鸟类进一步的遗传距离分析表明，雨燕科和燕科之间遗传距离较大，而各科内部种间遗传距离较小。因此，燕科鸟类和雨燕科鸟类亲缘关系较远，分别隶属于雀形目和雨燕目。

一直以来，金丝燕的分类系统及其物种的分类一直存在着很大的争议。一些研究者根据金丝燕的形态特征和窝特征来分类[29-30]，而另一些研究者是以金丝燕的回声定位能力来作为分类的依据[31]。有研究者曾把所有的金丝燕归依单一的属名为Collocalia[32]。这个分类用了一百多年，一直到发现回声定位能力的金丝燕。Brooke把金丝燕分为3个属名为无回声定位能力的Collocalia，无回声定位能力的Hydrochous(包括巨瀑布雨燕Hydrochousgigas)和回声定位能力的Aerodramus[33]。有关金丝燕属内种的划分依然存在不同的观点，因此还需通过进一步的分子生物学手段，采用序列更长以及更多的基因作为标记来进行系统发育树的重建，目前，虽然以线粒体DNA为标记进行系统发育和遗传分析的研究已经越来越普遍和成熟，然而，以多个线粒体基因标记结合形成串联序列以及线以粒基因和核基因标记相结合，特别是随着测序技术的迅速发展，利用高通量测序技术(第二代测序技术)测定物种全基因组已越来越普遍，这些新技术的产生和发展对系统发育和谱系地理的研究起到了很大的推动作用，从而更加容易产生标记基因更丰富、序列更长以及更可靠的分析结果。因此，对燕科和雨燕科等鸟类的系统发育研究还应该以多个标记基因以及更长的序列进行分析，从而阐明金丝雀属以及其他学界尚存在争议的物种分类和归属问题。